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贝氏隐孢子虫(Cryptosporidium baileyi)是禽类的优势虫种,主要寄生于宿主的喉头、气管、法氏囊、泄殖腔等部位,可引起呼吸系统疾病,给养禽业带来巨大的经济损失。然而,目前还没有用于C.baileyi的有效预防措施和治疗药物。近年的研究表明,非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)可以参与宿主与病原相互作用过程,调节宿主抗病毒、细菌和寄生原虫的免疫效应,特别是长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和环状RNA(circular RNA,circRNA)在许多疾病的发生和发展过程中发挥着重要的调节作用,并且还可作为多种疾病诊断和预后的有效生物标志。基于此,本研究以C.baileyi感染雏鸡为模型,首次研究了与C.baileyi感染相关的宿主lncRNA、mRNA和circRNA表达谱。1.成功建立了C.baileyi感染雏鸡模型:雏鸡正常饲养3 d后,经口感染1×10~6 C.baileyi卵囊,结果发现,在感染后5 d至29 d的粪便样品以及感染后2 d到27 d的气管组织样品存在卵囊,序列分析发现这些卵囊均为C.baileyi。排卵囊规律研究显示,排卵囊高峰出现于感染后10 d和16 d,并且以感染后10 d卵囊数量最多。感染后10 d的气管组织经HE染色和电镜观察发现试验组气管中存在卵囊感染,而对照组雏鸡气管组织中未发现虫体。2.获得了C.baileyi感染雏鸡的lncRNA与mRNA的表达谱:取感染C.baileyi 10 d的雏鸡气管,提取RNA,进行lncRNA和mRNA测序,共获得559 574 746个raw reads,过滤掉低质量序列后剩余545 479 934个clean reads。经过筛选,最终获得14 698个mRNA和1376个新的lncRNA,包括1161个基因间非编码RNA(long intergenic non-coding RNA,lincRNA)和215个反义lncRNA(anti-sense lncRNA)。以倍数变化(Fold Change,FC)>2.0和q<0.05为差异显著标准,在试验组与对照组间共获得差异表达的110个lncRNA(53个上调和57个下调)和948个mRNA(656个上调和292个下调)。随机选择10个mRNA(5个上调和5个下调)和10个lncRNA(5个上调和5个下调)进行qRT-PCR验证,发现qRT-PCR的结果与RNA测序(RNA-seq)的结果一致,从而验证了RNA-seq分析的有效性。此外,本研究利用qRT-PCR方法还检测了部分差异表达基因(6个mRNA和6个lncRNA)在C.baileyi感染后不同时间点(6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、5 d、10 d、16 d、28 d和29 d)的表达水平变化,发现它们在不同时间点均有不同程度的显著变化。靶基因预测显示,在14 418个mRNA和2570个lncRNA之间包含634 780条对应关系,并且一个lncRNA可以调节多个mRNA,一个mRNA也可以对应于多个lncRNA,这些lncRNA可能通过调节IL-4、IL-10、IL-17等细胞因子参与C.baileyi的感染与清除过程。功能富集分析发现,差异的mRNA和lncRNA的靶基因显著富集于Cryptosporidium感染相关的免疫通路。3.获得了C.baileyi感染雏鸡的circRNA表达谱:取C.baileyi感染后10 d试验组和对照组的雏鸡气管组织,进行circRNA测序,共获得9085个circRNA。以FC>2.0和p<0.05为标准,共筛选出104个差异显著的circRNA,包括65个上调和39个下调的circRNA。利用qRT-PCR方法对随机挑选的6个差异表达的circRNA(3个上调和3个下调)进行验证,其结果与RNA-seq结果的表达趋势相一致。靶基因预测结果显示,在9085个circRNA和978个miRNA之间存在相互作用关系。功能分析结果表明,差异circRNA的来源基因主要富集于一些代谢通路。另外,qRT-PCR分析发现差异表达的4个circRNA(2个上调和2个下调)在C.baileyi感染的整个过程中均有显著变化,提示它们可能参与宿主与病原之间的相互作用。综上所述,本研究首次运用高通量测序技术对雏鸡感染C.baileyi后的mRNA、lncRNA和circRNA表达谱进行了分析,共获得差异表达的948个mRNA、110个lncRNA和104个circRNA,这些RNA可能通过调控相关靶基因的表达在C.baileyi和宿主互作中发挥关键作用。此外,这些预测的mRNA、lncRNA和circRNA的相关信号通路将可用于充分揭示C.baileyi感染的发病机制。