【摘 要】
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乳腺癌是全球女性发病率与死亡率最高的恶性肿瘤类型。化疗一直是乳腺癌患者手术治疗预后较差时或晚期患者的首选治疗方案。然而单一化疗药物如5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）、紫杉醇等,由于毒副性和无组织选择性使得其临床应用受限。大量研究表明不同种类黄酮化合物均显示良好的抗乳腺癌活性。为此,我们研究了三种不同黄酮化合物白杨素（Chrysin,Chr）、染料木素（Genistein,Ge
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乳腺癌是全球女性发病率与死亡率最高的恶性肿瘤类型。化疗一直是乳腺癌患者手术治疗预后较差时或晚期患者的首选治疗方案。然而单一化疗药物如5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）、紫杉醇等,由于毒副性和无组织选择性使得其临床应用受限。大量研究表明不同种类黄酮化合物均显示良好的抗乳腺癌活性。为此,我们研究了三种不同黄酮化合物白杨素（Chrysin,Chr）、染料木素（Genistein,Gen）和木犀草素（Luteolin,Lut）分别与5-FU体外联合抗乳腺癌效果。目的:研究Chr、Gen和Lut单用或与5-FU联用对乳腺癌细胞周期、增殖、迁移及凋亡的影响,筛选出抗乳腺癌作用最佳的黄酮类化合物及Chr/Gen/Lut与5-FU抗癌细胞增殖的最佳协同比,进而构建乳腺癌靶向双药纳米共递送体系,提高药物在靶部位的蓄积量,降低药物在非病灶部位的浓度与毒副作用,提高两药联合抗乳腺癌效果。方法:（1）CCK-8实验考察游离单药Chr/Gen/Lut及其分别与5-FU共混给药后乳腺癌细胞增殖抑制效果,筛选出抗乳腺癌效果最佳的黄酮化合物,计算共混给药的协同指数（Combination Index,CI）,拟合CI曲线,筛选出Chr/Gen/Lut与5-FU共给药的最佳协同比。流式细胞术评估游离单药Chr/Gen/Lut及其分别与5-FU联用对细胞周期、凋亡的影响。划痕试验考察Chr/Gen/Lut及其分别与5-FU联用对于乳腺癌细胞迁移影响。（2）将5-FU经溴乙酸修饰得到5-氟尿嘧啶-1-乙酸（FUA）,Chr改性得到羧甲基化白杨素（Chr-COOH）。将叶酸（folic acid,FA）通过酰胺键偶联至第五代聚酰胺-胺（PAMAM G5.0）,得到靶向乳腺癌载体FA-G5.0,调控投料比将FUA与Chr-COOH以上述最佳协同比共负载到FA-G5.0上,制备乳腺癌靶向共递送体系FA-G5.0-FUA/Chr。（3）通过紫外分光光度法（UV）、红外分光光度法（IR）和氢核磁共振（H NMR）表征FA-G5.0-FUA/Chr结构及光谱学特性;用纳米粒度仪与Zeta电位分析仪表征FA-G5.0-FUA/Chr粒径分布、Zeta电位以及稳定性;用高效液相色谱法（HPLC）测定FA-G5.0-FUA/Chr中FUA与Chr-COOH载药量及其药物释放特性。（4）CCK-8法评估FA-G5.0-FUA/Chr对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）与正常乳腺细胞（MCF-10A）的毒性;溶血试验探究FA-G5.0-FUA/Chr的血液相容性;荧光拍照与流式细胞术考察FA-G5.0-FUA/Chr体外摄取情况及靶向性。（5）CCK-8法考察FA-G5.0-FUA/Chr对于乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231增殖抑制效果;划痕实验研究FA-G5.0-FUA/Chr对乳腺癌细胞迁移效果;选用流式细胞术分析FA-G5.0-FUA/Chr对乳腺癌细胞凋亡与周期影响。结果:Chr/Gen/Lut对于乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231的半抑制浓度（50%Inhibiting Concentration,IC50）24 h时为31.20～44.57μM,48 h为15.99～26.16μM。5-FU浓度范围在2～32μM内,与Chr/Gen/Lut联用均有较好的协同抗乳腺癌作用,且最佳协同比（摩尔比）均为1:2。Chr、Gen、Lut三者中,Gen细胞周期阻滞作用与凋亡诱导作用最佳,而Lut迁移抑制作用最强。Chr-COOH与Chr抗乳腺癌细胞增殖作用无显著差异。UV、IR和H NMR表征结果表明共递送体系FA-G5.0-FUA/Chr构建成功,其粒径为187.9 nm,Zeta电位为+11.7 m V,FA与PAMAM G5.0接枝比为5:1,FUA和C-COOH载药量分别为6.0%与19.5%,FA-G5.0-FUA/Chr体系具有较好的稳定性与缓释特性。FA-G5.0-FUA/Chr体系显示良好血液相容性、低正常细胞毒性及较好主动靶向性。FA-G5.0-FUA/Chr对于乳腺癌细胞IC50均显著低于游离单药,其在MCF-7、MDA-MB-231中凋亡率分别为30.27%、28.32%,迁移率分别为6.7%、15.6%,并将细胞周期阻滞在S期与G2期。结论:Chr、Gen、Lut对于两种乳腺癌细胞均表现出较好的抗增殖作用,并呈现出时间、剂量依赖性,其中Chr显示出最强的抗癌细胞增殖作用。将5-FU联合Chr以1:2（摩尔比）共接枝得到了具有优异理化特性的乳腺癌靶向纳米体系FA-G5.0-FUA/Chr,该体系在体外对于MCF-7、MDA-MB-231两种乳腺癌细胞均具有较好的抗增殖、周期阻滞、诱导凋亡及迁移抑制作用。
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