【摘 要】
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叶色是茶树的重要遗传特性之一,当花青素及其苷类在茶树叶片细胞内大量累积时,茶树叶片会呈现红紫色。花青素属于类黄酮化合物,花青素和糖基经糖基转移酶（glycosyltransferases,GTs）催化结合会形成稳定性更好、水溶性更强的花青苷,赋予植物颜色。催化花青苷合成的糖基转移酶是依赖尿苷二磷酸的糖基转移酶（UDP-glycosyltransferases,UGT）。尽管茶树芽叶呈现紫色的机制近
【基金项目】
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2016年博士科研启动费基金（编号:Z109021648）；
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叶色是茶树的重要遗传特性之一,当花青素及其苷类在茶树叶片细胞内大量累积时,茶树叶片会呈现红紫色。花青素属于类黄酮化合物,花青素和糖基经糖基转移酶（glycosyltransferases,GTs）催化结合会形成稳定性更好、水溶性更强的花青苷,赋予植物颜色。催化花青苷合成的糖基转移酶是依赖尿苷二磷酸的糖基转移酶（UDP-glycosyltransferases,UGT）。尽管茶树芽叶呈现紫色的机制近年来有了较为深入的研究,但对于参与紫芽茶树中花青苷合成的糖基转移酶尚未见系统报道。因此,筛选参与紫芽茶树花青苷合成的糖基转移酶基因并研究其相关功能,对探究茶树芽叶呈现紫色的形成机制具有积极意义。本试验在课题组前期研究的基础上,以湄潭苔茶紫芽茶树突变株的叶片为材料,首先对茶树叶片的主要色素含量进行了检测,并通过液质联用分析了主要花青苷种类;接着基于NCBI-blastp分析和本地BLAST软件,对茶树湄潭苔茶紫芽和绿芽转录组数据库和茶树基因组中UGTs序列进行了筛选,找到并克隆了8个糖基转移酶基因,利用保守结构域分析和进化树分析对这些基因进行了序列分析并采用荧光定量PCR检测了它们在紫芽突变株与对照绿芽茶树中的表达情况;最后对7个糖基转移酶进行了原核表达分析。研究结果如下:1.紫芽茶树和绿芽茶树一芽二叶新梢中的叶绿素、类胡萝卜素和花青苷总量分析表明,紫芽茶树新梢中的叶绿素、类胡萝卜素略高于绿芽茶树新梢,分别是绿芽新梢的1.51倍和1.21倍,而花青苷总量则显著高于绿芽茶树新梢,是绿芽茶树新梢的6.44倍。超高效液相-质谱联用仪对茶树芽叶中代谢物进行检测发现,2种茶树芽叶中都存在3种类型的花青苷,分别是矢车菊3-O-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷和飞燕草-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷,且它们在紫芽茶树新梢中的含量均显著高于绿芽茶树新梢。这些结果表明花青苷类的高浓度累积是本试验所用的紫芽茶树叶片呈现红紫色的主要原因。2.通过对茶树转录组数据库和茶树基因组数据库中UGTs序列进行了搜索,筛选并克隆出8条编码糖基转移的酶基因,CsUGT78A14、CsUGT78A15、CsUGT79B28、CsUGT79B29、TEA014249.1、TEA022583.1、TEA008907.1和TEA008918.1的开放阅读框分别为1 383 bp、1 365 bp、1 383 bp、1 374 bp、1 482 bp、825 bp、1 440 bp和1116 bp;保守结构域分析表明,基因TEA022583.1、TEA008907.1、CsUGT78A14、CsUGT79B29、CsUGT79B28所编码的蛋白可能负责茶树中花青素3-O-葡萄糖苷的合成;基因TEA014249.1、CsUGT78A15所编码的蛋白可能负责茶树中花青素3-O-半乳糖苷的合成;进化树分析表明,基因CsUGT78A14、CsUGT78A15、TEA022583.1所编码的蛋白属于3GT类;基因TEA014249.1编码的蛋白属于7GT或3’GT类;基因CsUGT79B28、CsUGT79B29、TEA008907.1所编码的蛋白都属于GGT类。（q）RT-PCR定量分析表明,基因CsUGT78A14、TEA022583.1、TEA014249.1在紫芽植株新梢中的转录水平均高于绿芽植株,而其他基因则是相反的表达趋势。3.构建了CsUGT78A14、CsUGT78A15、CsUGT79B28、CsUGT79B29、TEA014249.1、TEA008907.1和TEA022583.1基因的原核表达载体,并分别在E.coli HI-Control BL21（DE3）中进行原核表达,经IPTG诱导分别产生约65 k Da、65 k Da、66 k Da、66 k Da、69 k Da、67 k Da、43 k Da的融合蛋白,与预测蛋白分子量相符合;并利用His-TrapHP（GE Healthcare）纯化柱将以上蛋白进行纯化,得到相对单一的目的蛋白。
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