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[研究背景]从天然药用植物中寻找新型抗动脉粥样硬化药物对临床防治心血管疾病具有重要意义。项目组前期研究发现,源于云南特色药用植物叶下珠的活性成分-Corilagin具有潜在的抗动脉粥样硬化作用,值得进一步深入研发。本研究通过复制小型猪动脉粥样硬化模型及体外ox-LDL诱导的巨噬细胞损伤模型,研究不同剂量Corilagin对动脉粥样硬化的治疗作用;应用网络药理学方法探究Corilagin干预动脉粥样硬化形成发展的关键靶点及其相互关系;研究Corilagin对CD40-CD40L信号通路关键因子的调控作用。以期从整体动物、斑块组织、细胞和分子水平系统研究Corilagin治疗动脉粥样硬化的作用,探索其细胞分子生物学机制。[目 的]研究Corilagin对实验性动脉粥样硬化的治疗作用并探讨其细胞分子生物学机制。[方 法]1 Corilagin对动脉粥样硬化的治疗作用研究1.1动脉粥样硬化模型的复制:使用高脂饮食+球囊损伤复制小型猪动脉粥样硬化模型。1.2 Corilagin对血脂水平的影响:测定血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、ApoB、ApoE、Lp(a)水平。1.3组织病理学检查:分别使用油红O染色、HE染色、Masson染色对斑块组织进行病理学观察,评价Corilagin对斑块组织脂质沉积、病变程度、胶原纤维增生程度的影响。1.4免疫组织化学染色观察Corilagin对斑块组织MMP-1,-2,-9表达的影响。1.5 Western blotting 和 RT-qPCR 检测 Corilagin 对斑块组织中 TNF-α、NF-κB、MMP-1,-2,-9蛋白和mRNA表达的影响2 Corilagin对巨噬细胞增殖和泡沫化的影响2.1体外培养小鼠单核巨噬细胞,建立ox-LDL诱导损伤模型。2.2 MTT法测定不同浓度Corilagin对巨噬细胞增殖的影响。2.3油红O染色观察Corilagin对巨噬细胞泡沫化程度的影响。2.4 ELISA检测Corilagin对巨噬细胞脂质含量的影响。2.5免疫组织化学染色观察Corilagin对巨噬细胞NF-κB核转位的影响。2.6 Western blotting 和 RT-qPCR 检测 Corilagin 对巨噬细胞中 TNF-α、NF-κB、MMP-1,-2,-9蛋白和mRNA表达的影响。3网络药理学研究3.1通过Swiss和PharmMapper数据库进行Corilagin潜在的靶点预测,运用Disgenet和GeneCards数据库预测筛选与动脉粥样硬化相关的基因。3.2利用Cytoscape 3.9.0软件建立并构建成分-靶点-疾病网络可视化网络。3.3借助String数据平台进行蛋白互作网络构建,运用David数据库进行GO及KEGG作用通路分析。4 Corilagin 对 CD40-CD40L/TRAF-2/NF-κB 通路的调控作用4.1 Western blotting 检测 Corilagin 对斑块组织中 CD40、CD40L、TRAF-2、NF-κB蛋白表达的影响。4.2油红O染色检测Corilagin对巨噬细胞泡沫化程度的影响。4.3免疫荧光检测Corilagin对巨噬细胞CD40、CD40L蛋白表达的影响。4.4 Western blotting 和 RT-qPCR 检测 Corilagin 对巨噬细胞中 CD40、CD40L、TRAF-2、NF-κB蛋白和mRNA表达的影响。[结果]1 Corilagin对小型猪实验性动脉粥样硬化有明显的治疗作用1.1 Corilagin 能明显降低血清 TG、TC、LDL-C、ApoB、Lp(a)水平,升高 ApoE、HDL-C水平。1.2油红O染色、HE染色、Masson染色结果显示:Corilagin能明显减少斑块组织脂质沉积,减轻斑块组织病变程度,抑制斑块组织胶原增生。1.3免疫组织化学染色结果显示:Corilagin能明显下调斑块组织中MMP-1,-2,-9的表达。1.4 Western blotting和RT-qPCR结果显示:Corilagin能明显下调斑块组织中TNF-α、NF-κB 和 MMP-1,-2,-9 的蛋白及 mRNA 表达。2 Corilagin能明显抑制巨噬细胞增殖和泡沫化2.1 MTT法检测结果显示:Corilagin能明显抑制巨噬细胞增殖。2.2油红O染色结果显示:Corilagin能明显减轻巨噬细胞泡沫化程度。2.3 ELISA检测结果显示:Corilagin能明显减少巨噬细胞内TC和CE含量,并降低CE/TC值。2.4免疫组织化学染色结果显示:Corilagin能明显抑制巨噬细胞NF-κB核转位。2.5 Western blotting和RT-qPCR结果显示:Corilagin能明显下调巨噬细胞中TNF-α、NF-κB、MMP-1,-2,-9 的蛋白和 mRNA 表达。3网络药理学预测相关的分子靶点3.1 Corilagin治疗动脉粥样硬化的核心靶点共有116个,主要包括MMP-2和MMP-9 等。3.2 Corilagin通过关键靶点调控CD40-CD40L/TRAF-2/NF-κB信号通路等涉及细胞增殖、炎症反应、氧化应激及细胞凋亡等生物学过程来治疗动脉粥样硬化。4 Corilagin 对 CD40-CD40L/TRAF-2/NF-χB 通路的调控作用4.1 Western blotting结果显示:Corilagin能明显下调斑块组织中CD40、CD40L、TRAF-2、NF-κB的蛋白表达。4.2油红O染色检测结果显示:Corilagin能明显减轻巨噬细胞的泡沫化程度。4.3免疫荧光结果显示:Corilagin能明显下调巨噬细胞CD40、CD40L蛋白表达。4.4 Western blotting和RT-qPCR结果显示:Corilagin能明显下调巨噬细胞中CD40、CD40L、TRAF-2 和 NF-κB 的蛋白及 mRNA 表达。[结 论]Corilagin具有明显的抗动脉粥样硬化作用,可以下调斑块组织及巨噬细胞中TNF-α、NF-κB、MMP-1,-2,-9蛋白及mRNA的表达,抑制巨噬细胞增殖与泡沫化,其作用机制与调控CD40-CD40L/TRAF-2/NF-κB信号通路密切相关。