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据2020年全球最新癌症统计数据显示,结直肠癌的发病率高居全球恶性肿瘤第三位,且死亡人数位列恶性肿瘤第二位。氟尿嘧啶（FU）、奥沙利铂（OXA）是治疗结直肠癌的主要化疗药物,二者联合应用给晚期患者带来生存获益,但仍有部分病人出现耐药导致病情进展预后较差,因此探究影响结直肠癌化疗的分子机制有助于提高化疗效果。本研究前期通过非编码RNA芯片和生物信息学分析发现,FU与OXA联合应用显著改变了结直肠癌细胞中miRNA的表达,其中miR-183-5p的表达显著降低,进一步采用生物信息学的预测结果表明SOCS3是miR-183-5p的靶基因。miRNA是一种内源性、小的、非编码RNA,是重要的转录后调控因子,在细胞发育、细胞分化、细胞增殖和细胞类型特异性功能中起关键作用,并参与多种人类疾病的发病机制,参与肿瘤发生、细胞分化、远处转移和化疗耐药等过程。细胞因子信号转导抑制因子（suppressor of cytokine signaling,SOCS）家族是JAK/STAT信号通路负调控因子,其在维持细胞内环境稳定、诱导细胞凋亡、抑制细胞过度生长等方面发挥至关重要的调控作用,其家族成员SOCS3可抑制JAK激酶和STAT信号转导通路从而抑制肿瘤进展。目前研究发现,在结直肠癌中JAK/STAT信号通路参与调控PD-L1的表达,JAK-STAT3途径的激活可影响PD-L1表达;在体外实验中也证明激活JAK-STAT3诱导PD-L1的表达,进而诱导肿瘤进展。基于以上前期结果和现有研究进展,我们推测miR-183-5p通过调控SOCS3影响结直肠癌氟尿嘧啶和奥沙利铂的疗效。本课题首先研究通过评估miR-183-5p、SOCS3、PD-L1在CRC患者外周血和组织中的表达与临床病理特征的相关性,验证miR-183-5p、SOCS3、PD-L1在CRC发展进程中的作用（第一部分）;然后,进一步在细胞水平通过检测CRC细胞的增殖、凋亡、转移、趋化因子、免疫逃逸相关蛋白以及PD-L1的表达情况,验证FU和OXA联合处理通过miR-183-5p靶向SOCS3影响CRC细胞生长及PD-L1表达的分子机制（第二部分）;最后,通过构建小鼠异种移植模型,验证FU和OXA联合应用在体内通过miR-183-5p调控SOCS3影响CRC移植瘤生长和PD-L1表达的作用机制（第三部分）。第一部分 miR-183-5p、SOCS3、PD-L1在结直肠癌患者外周血和组织中的表达与临床病理特征的相关性研究[目的]分析miR-183-5p、SOCS3和PD-L1在结直肠癌患者外周血和组织中的表达及其临床意义。[方法]收集患者和健康对照人群的血液样本、患者的癌组织和癌旁组织样本及石蜡切片。RT-qPCR定量miR-183-5p在患者外周血和组织的表达;免疫组化检测SOCS3、PD-L1蛋白在患者癌组织样本中的表达;统计学分析miR-183-5p、SOCS3、PD-L1表达与结肠癌患者临床病理指标的关系。[结果]1.miR-183-5p在CRC患者外周血和癌组织中显著高表达,而SOCS3在癌组织中表达下调,PD-L1在癌组织中高表达。具体如下:miR-183-5p在癌组织中的表达高于癌旁组织（P＜0.001）;与无浸润患者相比,肿瘤浸润患者癌组织中miRNA-183-5p的表达进一步升高（P＜0.001）。miR-183-5p在CRC患者血液中的表达高于健康对照组（P＜0.001）,并且其表达升高与淋巴结转移、血管侵犯、肿瘤T分期相关。2.免疫组化检测显示SOCS3蛋白在癌组织中表达下调（P＜0.05）,PD-L1表达显著升高（P＜0.05）,SOCS3、PD-L1的表达水平均与患者的淋巴结转移、血管侵袭和较晚的T分期密切相关（P＜0.05）。并且SOCS3和PD-L1在CRC组织中的表达存在显著相关性（P＜0.05）。SOCS3和PD-L1在CRC癌组织中的表达是OS独立预测因素（P＜0.001）。[结论]miR-183-5p在结直肠癌患者癌组织和外周血中的表达显著升高,SOCS3在癌组织表达显著降低,PD-L1在结直肠癌组织中高表达。结直肠癌组织中SOCS3和PD-L1表达在不同pT分期具有良好预测预后价值,SOCS3和PD-L1是OS的独立预后因素。第二部分 氟尿嘧啶联合奥沙利铂通过miR-183-5p调控SOCS3影响结直肠癌细胞系HCT-116的凋亡、增殖、侵袭及PD-L1表达[目的]体外实验探究FU和OXA联合处理结直肠癌细胞对其生物学行为的影响及分子机制。[方法]1.MTT实验检测奥沙利铂和氟尿嘧啶对HCT-116细胞的IC50值;2.miRNA-seq检测氟尿嘧啶和奥沙利铂联合处理对HCT-116细胞miRNA表达的影响;miR-183-5p imhibitor、mimics转染用于miR-183-5p的敲降和过表达;pcDNA3.1-SOCS3和shRNA-SOCS3用于SOCS3的过表达和敲降转染;3.CCK-8和克隆形成实验检测结肠癌细胞HCT-116的增殖能力;Transwell实验检测细胞的侵袭和迁移能力;Annexin V-FITC/PI试剂盒结合Flow cytometry测定细胞凋亡;RT-qPCR检测miR-183-5p在癌细胞中的表达;Western blot检测目的蛋白SOCS3、PD-L1在结肠癌细胞中的表达水平;Western blot检测趋化因子（CCL1、CCL4、CCL7）和免疫逃逸相关蛋白（EGFR、STARD1、STARD3）的表达;双荧光素酶报告系统检测miR-183-5p与其靶基因SOCS3的靶向作用关系。[结果]1.FU与OXA联合作用显著抑制HCT-116细胞增殖、侵袭和迁移,促进凋亡,并显著下调免疫抑制相关因子PD-L1、CCL1、CCL4、CCL7、EGFR、STARD1和STARD3等的表达。2.miRNA-seq结果表明奥沙利铂和氟尿嘧啶联合处理显著降低了 HCT-116细胞中miR-183-5p的表达。3.细胞功能实验表明敲低miR-183-5p显著抑制肿瘤细胞的增殖、促进凋亡和阻滞G0/G1期细胞,下调PD-L1、CCL1、CCL4、CCL7、EGFR、STARD1和STARD3的表达;而过表达miR-183-5p具有相反的结果。双荧光报告基因实验结合Western blot证实SOCS3是miR-183-5p的靶基因。对miR-183-5p/SOCS3轴的功能探究结果表明与对照组相比,过表达SOCS3显著降低PD-L1的表达,而miR-183-5p和SOCS3同时过表达明显消除了 SOCS3对PD-L1的表达抑制,miR-183-5p通过靶向抑制SOCS3的表达而解除其对PD-L1表达的抑制作用。4.回复实验中,沉默SOCS3显著促进HCT-116细胞的恶性生物学行为,同时显著上调了 CCL4、CCL4、CCL7、EGFR、STARD1、STARD3 和 PD-L1 的表达。而 si-SOCS3+miR-183-5p 抑制剂组、si-SOCS3+si-PD-L1 组和 si-SOCS3+FU+OXA组中结直肠癌细胞的恶性生物学行为被显著恢复。[结论]FU联合OXA通过miR-183-5p/SOCS3轴下调PD-L1等免疫抑制因子的表达,抑制HCT-116细胞的恶性生物学行为。第三部分 氟尿嘧啶联合奥沙利铂在HCT-116细胞系Balb/c裸鼠移植瘤模型通过miR-183-5p调控SOCS3影响肿瘤增殖和PD-L1的表达[目的]构建HCT-116细胞移植瘤动物模型,体内验证FU和OXA联用通过miR-183-5p/SOCS3轴降低结肠癌移植瘤生长免疫抑制的分子机制[方法]1.Balb/c裸鼠皮下注射构建结肠癌移植瘤模型;2.miR-183-5p agomir和antagomir瘤内注射作为miR-183-5p的过表达和敲降的体内干预;3.慢病毒转染构建SOCS3敲降的HCT-116细胞;FU和OXA联合瘤内注射模拟化疗;体积测量绘制移植瘤生长曲线;TUNEL染色检测移植瘤组织细胞凋亡;免疫组化检测SOCS3、PD-L1的表达;RT-qPCR检测miR-183-5p在移植瘤组织的表达;Western blot检测目的蛋白SOCS3、PD-L1在移植瘤组织中的表达水平。[结果]1.与对照组相比,miR-183-5p agomir显著促进了移植瘤的成瘤能力和肿瘤生长,而miR-183-5p antagomir注射导致移植瘤的生长抑制。2.SOCS3对移植瘤的体内功能研究表明:敲降SOCS3显著增强HCT-116细胞皮下成瘤能力和肿瘤生长能力;其中,SOCS3沉默组裸鼠移植瘤的生长和肿瘤重量显著升高,细胞凋亡率与对照组相比明显降低。进一步的实验表明:FU和OXA联合应用显著降低了移植瘤的生长,促进移植瘤细胞凋亡;而敲降SOCS3显著减弱了联合化疗对裸鼠皮下肿瘤的体积和生长的抑制作用。此外,FU和OXA联合应用降低了移植瘤组织中miR-183-5p和PD-L1的表达水平;但是在敲降SOCS3的HCT-116细胞形成的移植瘤组中对PD-L1的表达影响并不显著。[结论]体内实验证实FU和OXA联合应用通过miR-183-5p调控SOCS3（下调miR-183-5p表达;促进SOCS3表达）抑制结直肠癌移植瘤生长和PD-L1的表达。