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[研究背景]肝衰竭具有很高的死亡率,肝移植是唯一有效的治疗措施,但供体的严重缺乏限制了肝移植在临床的应用。生物人工肝（BAL）是目前最有前景的治疗方法,对BAL的研究虽然已经取得了很大的进展,但是在理论和实践方面仍存在许多需要改进的地方,比如:缺少合适的肝细胞来源和完善培养方式;能得到足够多的具备正常肝脏功能的细胞;缺乏符合肝脏生物工程学特性的生物反应器等。许多研究表明,肝脏非实质细胞（NPC）在肝脏（病理）生理学和原代肝细胞功能的维持中起着重要作用。目前研究焦点之一是将多种肝细胞类型整合到生物反应器中,寻找最合适的肝NPC细胞以及最合适的细胞比例是研究的热点。Kupffer细胞（KCs）是肝脏固有的巨噬细胞,具有吞噬和清除功能,而且可以分泌TNF-α、HGF、EGF、TGF等细胞因子能有效促进肝细胞增殖,理论上应能使BAL的功能更加完善。而将肝细胞与Kupffer细胞共培养作为生物人工肝功能细胞来源的研究却较少。前期课题组成功建立了二维（2D）的乳猪原代肝细胞与Kupffer细胞共培养模型,并确立了12:1是最适合的比例。此外,研究发现三维培养可以重建类似于生理的环境,可以改善细胞的功能。旋转细胞培养系统（RCCS）可以模拟微重力环境,具有促进细胞三维增殖与分化、低剪切力、高效的物质传递及高密度培养的特点。综上所述,结合共培养与3D培养的优势,本研究在RCCS利用微载体建立肝细胞与KCs以12:1比例直接接触的共培养模型并对共培养机制进行初步探索,为构建高效、经济实用的生物人工肝系统的种子细胞提供实验依据。[目的]本研究旨在建立一种稳定、高效的分离乳猪原代Kupffer细胞同时又能分离高质量肝实质细胞的实验方法,进一步在RCCS中利用微载体建立肝细胞与KCs以12:1比例直接接触的共培养模型,评估原代乳猪肝细胞和Kupffer细胞在RCCS内模拟微重力条件下共同培养的可行性,为构建高效、经济实用的生物人工肝系统的种子细胞提供实验依据。进而从基因水平探索KCs及RCCS的模拟微重力环境对共培养肝细胞的作用;探索TNF-α、HGF、IL-6等可溶性细胞因子在肝细胞与Kupffer细胞共培养中的作用。[方法]本研究分为三部分:1、采用自行设计的体外循环灌注系统,分别对乳猪肝脏（每组5例）进行传统的两步离体胶原酶灌注法及改良的四步半原位胶原酶灌注法灌注获得肝细胞悬液,通过低速离心分离肝实质细胞,利用25%Percoll和50%Percoll的密度梯度离心结合30分钟或15分钟贴壁纯化的方式分离Kupffer细胞;对不同灌注方法及不同贴壁纯化时间获得的KCs及肝实质细胞的产量、活性及纯度进行对比研究。2、建立原代乳猪肝细胞与Kupffer细胞在培养板中（2D）及在RCCS（3D）中按12:1比例直接接触的共培养模型。通过显微镜观察细胞形态变化;MTT染色观察细胞活性;CCK-8检测细胞增殖情况,绘制细胞生长曲线。检测肝细胞单独培养组（2D,3D）及共同培养组（2D,3D）培养1、3、5、7、9、11天的培养上清中ALT、AST、LDH、GLU、BUN、ALB水平。用超高效液相色谱质谱联用仪检测西泮浓度,评价不同培养组肝细胞对地西泮的代谢能力。3、用RT-PCR法检测培养1,3,5天肝细胞功能相关基因的表达,比较分析单独培养组（2D,3D）与共培养组（2D,3D）肝细胞功能基因表达水平的差异。采用ELISA方法检测肝细胞单独培养组（2D,3D）、Kupffer细胞单独培养组（2D）及肝细胞与KCs共培养组（2D,3D）培养上清中的HGF、TNF-α、IL-6水平并比较分析各组间的差异。[结果]1、改良的四步半原位胶原酶灌注法结合15分钟的贴壁纯化时间分离的KCs数量虽低于贴壁纯化30分钟组,但收获的KCs活率、纯度均显著高于二步或四步灌注法结合贴壁纯化30分钟收获的KCs。同时改良的四步半原位胶原酶灌注法获得的肝细胞产量、活率、纯度显著高于二步离体胶原酶灌注法。2、与单独培养组比较,2D共培养组肝细胞能更长时间维持肝细胞形态,3D共培养组形成的细胞-微载体聚集体体积更大,增殖能力更强,存活时间更长。3D单独及共培养组的AST、LDH水平分别低于2D单独培养组及共培养组;3D及2D的共培养组AST、LDH水平分别低于3D及2D单独培养组。在一定时间2D、3D共培养组及3D单独培养组中GLU较2D单独培养组消耗更多;2D及3D共培养组ALB、BUN水平分别高于2D和3D单独培养组;3D单独及共培养组中的ALB、BUN水平高于相应的2D单独及共培养组。对地西泮的代谢能力2D共培养组较单独培养组强;3D共培养组与单独培养组之间没有显著差异,在培养的第9、11天3D单独及共培养组较2D单独及共培养组强。3、在培养的第3或5天3D单独及共培养组肝细胞的Albumin、G6P、CSP-1、HNF-4 α、Claudin-3、CYP1A2、CYP3A4等功能基因表达水平分别高于2D单独及共培养组;2D及3D的共培养组的Albumin、G6P、CSP-l、CYP1A2、CYP3A4等基因的表达高于相应的2D及3D单独培养组。2D、3D肝细胞单独培养组均未测到HGF、IL-6及TNF-α;此外,2D、3D共培养组中的HGF、IL-6高于KCs单独培养组;在培养的第5、7、9天,3D共培养组的HGF、IL-6水平高于2D共培养组。[结论]1、改良的四步半原位胶原酶灌注法结合15分钟的贴壁纯化时间分离的KCs活性、纯度更高,是一种稳定、经济的获得高纯度KCs的方法,可以满足后续实验的要求;此外,该方法可以同时获得产量高、活性好、纯度高的肝细胞。2、首次成功建立原代乳猪肝细胞与Kupffer细胞利用微载体（Cytodex-3）在RCCS中按12:1比例直接接触的共培养模型,肝细胞表现出更好的增殖、合成及代谢功能。肝细胞与Kupffer细胞在RCCS中共培养有望成为生物人工肝理想的细胞材料及培养方式之一。3、RCCS的模拟微重力环境可促进肝细胞Albumin、G6P、CSP-1、HNF-4α、Claudin-3、CYP1A2、CYP3A4等功能基因的表达,促进细胞的增殖和分化。KCs与肝细胞以12:1比例共培养时,在一定时间可促进肝细胞Albumin、G6P、CSP-1、CYP1A2、CYP3A4等功能基因的表达,提高肝细胞功能;KCs分泌的HGF、IL-6及TNF-α,可能是促进肝细胞增殖、改善肝细胞功能的重要因素。