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背景急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)是由于各种直接或间接的致伤因素导致的肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞受损,表现为肺的顺应性下降、顽固性的低氧血症、高碳酸血症、呼吸窘迫,最终发展为急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)。ALI的发病机制十分复杂,目前还没有完全阐述清楚。以往研究认为,炎症反应是诱发和加重ALI的决定性因素。当机体受到外源性刺激或者自身生理机能紊乱时,免疫系统被激活,引起相关趋化因子和炎性因子的释放以及中性粒细胞的大量聚集,以抵抗和清除对机体有害的各种因素。而炎症反应对机体自身也存在伤害作用,过度的炎症反应会加重生理机能受损,在肺组织中主要表现为肺的血气交换屏障受损。与成年人相比,新生儿的肺泡发育还不够完善,自身调节能力有限,很容易受到各种外来刺激的影响而发生功能障碍。1989年,Faix等率先报道了11例足月新生儿ALI/ARDS,之后相继有足月新生儿、早产儿、低体重儿等多种类型ALI/ARDS的病例报道。近年来,有关新生儿ALI/ARDS的报道越来越多,研究中发现,新生儿ALI与成人和儿童均有所不同,其起病更快,病程进展更迅速,低氧血症更为严重。在新生儿ALI的诱发因素中,胎粪吸入和感染是最常见的两个发病原因。一氧化碳(Carbon monoxide,CO)在体内微量存在,主要由血红素加氧酶(Heme oxygenase,HO)分解血红素生成。目前的研究表明,CO在体内发挥着重要的生理调节作用,包括扩张血管、抗炎症、抗凋亡、抗细胞增殖等作用。在各种ALI的动物模型中发现,低剂量的CO具有明显减轻ALI的作用,其机制研究主要集中在CO的抗炎症作用方面。而对于CO的抗凋亡作用,尤其是对肺泡二型上皮细胞(Alveolar typeⅡepithelial cells,AEC-Ⅱ)的凋亡影响迄今还未见报道。目的探讨CO对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的新生鼠ALI时AEC-Ⅱ凋亡的影响及其分子机制。方法一、CO对LPS诱导的新生鼠ALI的影响1.创建LPS诱导新生鼠ALI模型,通过观察肺组织病理变化,湿干比(Wet-to-dry ratio,W/D),肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中白细胞数量和蛋白含量变化确定模型建立是否成功;2.制备失活性一氧化碳释放分子3(Inactive carbon monoxide releasing molecule3,i CORM3):将制备好的一氧化碳释放分子3(Carbon monoxide releasing molecule3,CORM3)于室温下放置18h,使CORM3充分分解释放出CO气体,剩下的部分即为羰基骨架结构i CORM3;3.观察CORM3对LPS诱导的新生鼠ALI的保护作用,观察指标:H-E染色,W/D比值、BALF中白细胞数量及蛋白含量变化;4.观察CORM3对LPS诱导的新生鼠AEC-Ⅱ凋亡的影响,末端标记法(Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling,TUNEL)染色观察肺泡细胞凋亡情况,TUNEL+肺表面活性物质C(Surfactant protein C,SP-C)免疫荧光观察AEC-Ⅱ凋亡变化。二、CO对LPS诱导的A549细胞凋亡影响1.MTT法观察不同浓度LPS对A549细胞活力的影响;2.MTT法观察不同浓度CORM3对LPS刺激的A549细胞活力的影响;3.TUNEL法观察CORM3对LPS刺激的A549细胞凋亡的影响;4.JC-10染色观察线粒体膜电位变化;5.蛋白免疫印迹法(Western-Blot,WB)检测线粒体内和胞浆内细胞色素C(Cytochrome C)含量变化;6.酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,Elisa)检测活化的Caspase 3变化。结果一、CO对LPS诱导的新生鼠ALI的影响1.与control组相比,LPS组肺组织结构明显紊乱,肺间隔明显增宽,肺泡及其间质内大量中性粒细胞堆积;W/D比值、BALF细胞数量及蛋白含量显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。CORM3组与LPS相比,肺组织病理变化明显改善,肺泡及间质内中性粒细胞数量明显减少;W/D比值、BALF中白细胞数目及蛋白含量升高趋势明显回落,差异具有统计学意义(P<0.05)。i CORM3组与LPS组相比,上述观察与检测指标无明显变化(P>0.05)。说明在LPS诱导的新生鼠ALI中,CORM3能起到明显的抑制作用。2.与control组相比,LPS组肺组织AEC-Ⅱ凋亡明显增加,二者差异具有统计学意义(P<0.05);CORM3组与LPS相比,肺组织AEC-Ⅱ凋亡数目明显减少,其差异具有统计学意义(P<0.05);i CORM3组与LPS组相比,上述指标无明显变化(P>0.05)。说明在LPS诱导的新生鼠ALI中存在AEC-Ⅱ凋亡,CORM3干预能抑制新生鼠ALI中的AEC-Ⅱ凋亡。二、CO对LPS诱导的A549细胞凋亡影响1.随着LPS作用浓度的增加,A549细胞活力明显下降,其趋势变化在100-400ug/ml浓度之间最为显著(P<0.05)。2.与LPS组相比,给予CORM3干预后,A549细胞活力明显增强,且增强趋势与CORM3浓度呈正相关;i CORM3组与LPS组相比无明显变化(P>0.05)。3.与control组相比,LPS组TUNEL荧光信号明显增强,提示A549细胞凋亡增多,二者比较具有统计学差异(P<0.05);CORM3组与LPS相比,A549细胞凋亡数目有所减少,二者比较具有统计学差异(P<0.05);而i CORM3组无明显变化(P>0.05)。4.在control组中,JC-10以聚合体形式存在于线粒体内膜中,显微镜下显示红色荧光信号,线粒体膜电位水平较高;LPS组JC-10主要以单体形式存在,显微镜下以绿色荧光为主,说明线粒体膜电位下降明显;给予CORM3干预后,细胞线粒体膜电位有所回升,而i CORM3组无明显变化。5.在control组中,Cytochrome C主要存在于线粒体中,胞浆含量较少;经LPS刺激后,线粒体内Cytochrome C有所减少,胞浆内Cytochrome C含量增多;给予CORM3干预后,线粒体内Cytochrome C逐渐增多;在i CORM3组中,线粒体内Cytochrome C含量与LPS组相比无明显变化。这些结果表明:LPS刺激后,线粒体膜电位降低,通透性增强,线粒体内Cytochrome C转移进入胞浆中,给予CORM3干预后,抑制了线粒体内Cytochrome C进入胞浆的趋势。6.与control组相比,给予LPS刺激以及CORM3治疗,Caspase 3活性均无明显变化(P>0.05)。结论1.CO能减轻LPS诱导的新生鼠ALI;2.CO能抑制LPS引起的ALI时AEC-Ⅱ凋亡;3.CO能降低LPS诱导的A549细胞凋亡,且作用机制可能并不依耐于Caspase途径。