脑膜瘤是中枢神经系统多见的原发性颅内肿瘤之一,来源于蛛网膜帽状细胞,紧贴硬脑膜。发病率仅次于胶质瘤,占颅内肿瘤的35%左右,并且呈逐年升高趋势。根据2016年WHO中枢神经系统肿瘤分类,脑膜瘤分为WHO I级（良性脑膜瘤）、WHO II级（非典型脑膜瘤）和WHO III级（恶性脑膜瘤）3个等级,其中WHO I级脑膜瘤占80%左右,而WHO II级及III级脑膜瘤,分别占10-18%和2-4%。大多数良性脑膜瘤可以完全切除,预后良好。但也有一些脑膜瘤,因发病部位或侵袭重要血管神经等原因,往往不能完全切除,尽管采取了包括放疗、化疗及药物治疗在内的综合治疗,仍存在较高的复发风险,预后较差,其复发率及恶性程度与脑膜瘤向邻近脑实质的侵袭的能力密切相关。WHO II级和WHO III级脑膜瘤侵袭性较WHO I级强,预后也差。因此,深入探讨脑膜瘤的分子机制,对寻找新的药物作用靶点,提高脑膜瘤的治疗结果,降低患者痛苦,并最终改善患者的预后具有重要的意义。脑膜瘤的发病机制至今为止尚未完全明确。与多数肿瘤相似,环境的改变可造成肿瘤表观遗传的不稳定性,导致一些基因异常表达,作用于遗传易感性的个体而发病,这有可能是肿瘤发病的主要病因。研究发现,单核苷酸基因多态性位点在许多肿瘤的易感性中发挥了重要的作用,它们主要通过影响基因转录活性和蛋白表达活性而导致个体间的遗传差异。Grb2相关结合蛋白1（GRB2-associated binding protein 1,GAB1）,是一种蛋白质间相互作用的支架蛋白,在肿瘤的发生和发展中发挥着重要的作用。有研究显示GAB1在脑膜瘤中高表达,可能与肿瘤的侵袭性有关。GAB1含有常见位点的多态性与多种肿瘤的易感性密切相关,如胆道癌及肺癌等,也有一些常见位点在良性疾病如高血压病种发挥了作用。但目前为止,尚无GAB1基因多态性与脑膜瘤患病风险的相关性研究报道。微小RNA（miRNA）是一类内源性、短、单链、非编码RNA分子,也是一种重要的表观遗传因子。miRNA通过与靶基因3’非翻译区（3’UTR）区结合,调控转录后基因表达,从而在疾病发生发展中发挥生物学作用。miR-153-5p是一种新发现的micro RNA,可以在人类肿瘤,尤其是中枢神经系统肿瘤的发生发展过程中发挥重要的生物学作用。近期的研究结果表明,miR-153-5p直接靶向SNAI2,抑制胶质母细胞瘤细胞的侵袭和迁移,充当了“抑癌基因”的角色。然而,miR-153-5p与脑膜瘤的相关研究至今未见报道。本实验首先分析GAB1的基因多态性与脑膜瘤易感性的相关性,其次探讨了miR153-5p及靶基因GAB1在脑膜瘤中的表达情况及其相关性,最后对miR153-5p靶向GAB1通过调控MEK/ERK通路抑制恶性脑膜瘤细胞增殖和侵袭的可能性和机制进行了初步探讨。本研究通过对miR153-5p及GAB1在脑膜瘤发病中的作用及机制进行探讨,从而可能为脑膜瘤的发病机制和基因治疗提供理论依据,为脑膜瘤的诊断提供新的生物学检测指标和靶向治疗提供新的思路。第一部分GAB1基因多态性与脑膜瘤易感性的相关性研究目的:探讨中国北方汉族人群中GAB1基因多态性（SNPs）与脑膜瘤易感性的相关性。方法:于2019年3月至2021年5月从河北医科大学第二医院及邯郸市中心医院共纳入研究对象共502例,包括205例脑膜瘤患者作为病例组和297例健康成人作为对照组。分析GAB1基因的4个位点（rs3805246,rs3828512,rs3805236和rs1397529）的等位基因和基因型频率与脑膜瘤易感性及临床特征的关系。结果:rs3805236的等位基因频率和基因型频率分布差异有明显统计学意义。次要等位基因G在脑膜瘤组的频率分布（30.2%）明显高于健康对照组（20.9%）,提示次要等位基因G是脑膜瘤的风险等位基因（P=0.001,OR=1.675,95%CI=1.252-2.240）。通过应用遗传基因模型分析,在共显性、显性和隐性遗传模型下均具有统计学意义。其中,在最优模型隐性模型中,rs380523 GG基因型在脑膜瘤中频率增高,增加了脑膜瘤的易感性（P=0.001,OR=1.675,95%CI=1.252-2.240）。GAB1 rs1397529的等位基因频率和基因型频率分布也有明显统计学意义。次要等位基因C在脑膜瘤组的频率分布（11.2%）明显高于健康对照组（7.1%）,提示次要等位基因C是脑膜瘤的风险等位基因（P=0.001,OR=1.675,95%CI=1.252-2.240）。此外,遗传模型分析结果显示,共检出两种基因型AA及AC,在共显性模型下,携带杂合体AC基因型的个体与携带野生型纯合体AA基因型相比更容易患病（P=0.020,OR=1.737,95%CI=1.090-2.768）。将脑膜瘤病例组按照临床特征分层分析发现,携带AC基因型的脑膜瘤患者较携带AA基因型的患者硬膜侵袭率明显增高,差异具有统计学意义（P=0.027）,表明AC基因型可能在脑膜瘤的侵袭性方面发挥了作用（P=0.020,OR=1.737,95%CI=1.090-2.768）。GAB1基因另外2个SNPs（rs3805246,rs3828512）的等位基因频率和基因型频率与脑膜瘤无明显相关性。小结:本研究首次发现GAB1基因内含子区rs3805236 A＞G和3’UTR rs1397529 A＞C多态性增加了中国北方汉族人群脑膜瘤的风险。GAB1rs1397529 A＞C与脑膜瘤患者的硬脑膜侵袭性有关,次要等位基因C是脑膜瘤硬脑膜侵袭的风险等位基因,并且可能潜在的增加脑膜瘤侵袭性。第二部分miR-153-5p和GAB1在脑膜瘤组织中的表达差异及临床意义目的:探讨miR-153-5p、GAB1 mRNA及其蛋白在脑膜瘤组织中的表达水平及其与脑膜瘤患者临床特征的相关性。方法:1.应用RT-qPCR或免疫组化检测miR-153-5p、GAB1 mRNA及其蛋白在正常硬脑膜与不同级别脑膜瘤组织中的表达,并分析其与脑膜瘤患者临床特征的关系。2.应用Pearson相关性分析miR-153-5p和GAB1 mRNA在脑膜瘤组织中表达水平的相关性。3.绘制ROC曲线,评估miR-153-5p及GAB1在脑膜瘤中的诊断效能。4.依据GAB1检测位点不同基因型分层分析miR-153-5p、GAB1mRNA及蛋白表达差异。结果:1.miR-153-5p及GAB1 mRNA在正常硬脑膜与不同级别脑膜瘤组织表达差异。RT-qPCR实验结果显示,与正常硬脑膜组织相比,脑膜瘤组织中miR-153-5p的表达量明显减少（P＜0.05）,GAB1的mRNA表达量明显增多（P＜0.01）,差异有统计学意义。与WHOⅠ级脑膜瘤组织相比,WHOⅡ、WHOⅢ级脑膜瘤组织中miR-153-5p的表达量显著减少,GAB1的mRNA表达量显著增多,差异均具有统计学意义（均P＜0.01）。然而,miR-153-5p和GAB1 mRNA在WHOⅡ、WHOⅢ级脑膜瘤组织的表达量差异均无统计学意义（均P＞0.05）。2.GAB1蛋白在正常硬脑膜与不同级别脑膜瘤组织表达免疫组化结果显示GAB1主要表达于细胞质中。正常硬脑膜组织中GAB1表达阴性（-）病例数为3/10例（30.00%）,WHOⅠ级脑膜瘤组织中GAB1表达阴性（-）病例数为4/30例（13.33%）,而WHOⅡ和Ⅲ级脑膜瘤组织中则无阴性（-）患者。WHOⅠ～Ⅲ级GAB1表达（++）病例数分别为17/30例（56.66%）、10/15例（66.66%）和1/5例（20.00%）,WHOⅠ～Ⅲ级GAB1的表达（+++）病例数分别为1/30例（3.33%）、2/15例（13.33%）和4/5例（80.00%）。与正常硬脑膜比较,脑膜瘤组织中的GAB1表达阳性细胞数增高,差异具有统计学意义（P＜0.001）。且在不同级别脑膜瘤间,随着脑膜瘤的WHO分级不断升高,GAB1的蛋白表达水平越高,差异也有统计学意义（P＜0.001）。3.miR-153-5p和GAB1 mRNA在脑膜瘤组织中表达水平的相关性Pearson相关性分析显示,脑膜瘤患者组织中miR-153-5p的相对表达量与GAB1 mRNA的相对表达量呈中等程度的负相关（r=-0.521,P＜0.001）。4.miR-153-5p及GAB1mRNA在脑膜瘤中的诊断效能绘制ROC曲线,结果如下:miR-153-5p和GAB1 mRNA的ROC的AUC分别为0.7355、0.7564,均具有统计学意义（P＜0.001）,两者对脑膜瘤的诊断准确性均较高。5.miR-153-5p及GAB1mRNA在脑膜瘤中的表达与患者临床特征的关系采用Mann-Whitney U检验分析,结果显示:相对硬脑膜未侵袭组,硬脑膜侵袭组miR-153-5p表达水平下调及GAB1 mRNA表达水平上调（均P＜0.05）。在肿瘤分级方面也有显著差异,见结果1。两者的mRNA表达在患者的年龄、性别、瘤周水肿方面均无明显差异（P＞0.05）。二元逻辑回归结果发现:miR-153-5p下调和GAB1上调都是硬脑膜侵袭和肿瘤分级的危险因素（均P＜0.05）。6.miR-153-5p、GAB1 mRNA及蛋白依据不同GAB1检测位点基因型分层分析结果在隐性遗传模型下,根据GAB1 4个SNPs（rs3805246,rs3828512,rs3805236和rs1397529）的基因型分别进行分层分析,比较基因型亚组之间miR-153-5p及GAB1 mRNA的表达水平,发现两者均无统计学意义。然而,与携带rs1397529AA基因型的脑膜瘤患者相比,携带AC基因型的脑膜瘤患者GAB1蛋白表达水平上调,差异具有统计学意义（P＜0.05）。根据其他位点基因型分组的脑膜瘤患者GAB1表达组间差异无统计学意义（P＞0.05）。小结:miR-153-5p及GAB1mRNA在正常硬脑膜组织及脑膜瘤中均表达,但在脑膜瘤组织中miR-153-5p表达下调,GAB1mRNA表达上调。GAB1的蛋白在脑膜瘤组织中表达显著升高,且表达水平与病理分级呈正相关。相对硬脑膜未侵袭组,硬脑膜侵袭组miR-153-5p下调及GAB1mRNA上调。且miR-153-5p下调和GAB1 mRNA上调都是硬脑膜侵袭和肿瘤分级的危险因素。GAB1 rs1397529（AC vs AA）位点携带AC基因型的脑膜瘤患者GAB1的蛋白表达水平上调,由此推测rs1397529风险基因型AC可能通过调控GAB1的蛋白表达而影响脑膜瘤的发生发展。第三部分miR-153-5p靶向GAB1调控MEK/ERK通路抑制恶性脑膜瘤细胞增殖和侵袭的机制研究目的:探讨miR-153-5p可能靶向GAB1通过调控MEK/ERK通路抑制恶性脑膜瘤细胞增殖、侵袭及迁移。方法:1.双荧光素酶报告基因用于靶基因的验证。通过应用在线预测软件Target Scan分析miR-153-5p与GAB1 3’UTR的结合序列,构建质粒:GAB13’UTR区野生型GAB1 3’UTR（WT）,突变型质粒GAB13’UTR（hsa-miR-153-5p MUT）。用miR-153-5p模拟物,荧光素酶、肾素和构建质粒共转染H293T细胞。使用荧光素酶测定系统（Promega）定量荧光素酶活性。2.体外培养恶性脑膜瘤细胞株IOMM-Lee,应用miR-153-5p mimics、miR-153 inhibitor、GAB1 siRNA及GAB1 siRNA+miR-153 inhibitor瞬时转染,通过CCK-8实验、Transwell试验以及细胞划痕实验,观察其对恶性脑膜瘤细胞增殖、侵袭以及迁移的影响,RT-qPCR检测GAB1mRNA的表达水平,Western blot检测GAB1蛋白,MEK/ERK通路关键因子MEK1、p-MEK1、ERK1/2、p-ERK1/2表达水平。结果:1.GAB1是miR-153-5p的靶基因我们通过应用在线预测软件Target Scan（http://www.Target Scan.org）中的数据库进一步分析miR-153-5p能够靶向结合GAB1 3’UTR的结合位点,发现miR-153-5p可以与GAB1 3’UTR的四个位点结合。首次突变了位于GAB1基因上SNP rs1397529所在的第三结合序列。结果显示miR-153-5p过表达对抑制野生型和突变型GAB1载体的荧光活性没有影响。然而,当利用互补突变对预测的miR-153-5p靶向结合GAB1 3’UTR的四个位点进行了全部突变后,结果显示,miR-153-5p可以调控带有GAB1 3’UTR野生型的荧光素酶活性的表达（P＜0.0001）;而在结合位点突变后,这种调控关系有所消失（P＜0.0001）。2.miR-153-5p通过靶向GAB1抑制恶性脑膜瘤细胞增殖、迁移和侵袭CCK-8增殖实验分析表明,与正常对照组相比,GAB1沉默、GAB1+miR-153-5p共沉默及miR-153-5p过表达均明显抑制了恶性脑膜瘤细胞的增殖,而miR-153-5p沉默则明显促进了恶性脑膜瘤细胞的增殖。Transwell侵袭试验结果表明,与正常对照组相比,GAB1沉默、GAB1+miR-153-5p共沉默及miR-153-5p过表达明显使恶性脑膜瘤细胞的侵袭能力明显受到抑制,而miR-153-5沉默则使恶性脑膜瘤细胞的侵袭能力显著提高。细胞划痕实验结果显示,相较正常对照组,GAB1沉默、GAB1+miR-153-5p共沉默及miR-153-5p过表达明显抑制了的细胞迁移,而miR-153-5沉默则明显促进了细胞迁移。这些结果说明,miR-153-5p过表达可抑制脑膜瘤细胞的增殖、迁移和侵袭力,GAB1沉默部分阻断了miR-153-5p沉默对恶性脑膜瘤细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用,miR-153-5p可能通过靶向GAB1抑制恶性脑膜瘤细胞增殖、迁移和侵袭。3.miR-153-5p通过抑制GAB1-MEK/ERK轴发挥作用为了进一步探讨miR-153-5p作用的机制,我们检测了GAB1-MEK/ERK轴的标志性的基因产物的表达。与正常对照组相比,miR-153-5p过表达导致恶性脑膜瘤细胞GAB1mRNA和蛋白表达显著降低（均P＜0.05）,miR-153-5p沉默可引起GAB1 mRNA表达有增加,但无统计学意义。然而,miR-153-5p沉默可使GAB1蛋白表达显著增加（P＜0.05）。与正常对照组组相比,miR-153-5p过表达,GAB1蛋白表达降低,MEK1、ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白表达显著降低,结果均具有统计学意义（均P＜0.01）。p-MEK1表达的蛋白表达也有所下降,结果未达到统计学意义。而miR-153-5p沉默后,随着GAB1蛋白表达的增加,MEK1、ERK1/2、p-MEK1、p-ERK1/2的表达也随之而增加,然而仅ERK1/2的表达上调具有统计学意义（P＜0.05）。这些结果表明miR-153-5p可能是通过抑制GAB1表达从而调控MEK/ERK通路的激活。小结:miR-153-5p可下调其靶基因GAB1的表达,并调控MEK/ERK信号通路活性,进而抑制恶性脑膜瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。