透明质酸酶（Hyaluronidase,HAase）是一种能够降解透明质酸（Hyaluronic acid,HA）的糖苷酶,主要作用于β-1,3糖苷键或β-1,4糖苷键,在一定程度上还可催化软骨素和硫酸软骨素。在临床医疗、制革工艺等方面有着广泛的应用,同时作为制备低分子量透明质酸的主要制剂而引起人们的广泛关注。目前,对透明质酸酶的研究主要集中在动物和细菌方面,对真菌中透明质酸酶的研究报道甚少,因此本文对大型真菌灵芝中的透明质酸酶进行异源表达、酶学性质研究及定点突变,以期对透明质酸酶的研究提供有利的理论依据。主要研究内容和结果如下:1.透明质酸酶重组质粒的构建及异源表达通过NCBI数据库获取灵芝的透明质酸酶基因序列（Gen Bank:LR729866.1）,设计引物后运用PCR技术获取目的基因,其大小为1683 bp,以pET-15b为载体构建重组质粒,并将其命名为pET-15b-HAase,然后转化入大肠杆菌BL21中进行诱导表达,利用亲和层析原理通过Ni-NTA柱进行纯化,经SDS-PAGE检测分析,目标蛋白大小约为62 k Da。2.野生型酶学性质表征通过还原糖检测法（DNS法）对野生型酶学性质进行研究,其最适反应温度为40℃;最适p H值为5.0;底物特异性结果显示对透明质酸的活力最高,并对硫酸软骨素也有一定的降解效果;金属离子中一价K+、二价Mg2+、Cu2+和三价Al3+随着浓度的增加,对酶的抑制效果增强,其中Cu2+抑制效果最明显,Na+随着浓度的增加对酶的抑制效果反而减小,三价Fe3+在低浓度时具有明显的激活作用,随着浓度的增加也呈现出抑制趋势;有机溶剂中甲醇和丙三醇呈现出低浓度促进高浓度抑制的趋势,乙醇和二甲基亚砜随着浓度的增加抑制效果越强;以透明质酸为底物,其酶促反应动力学曲线符合米氏方程,在最适反应条件下Km=0.502 mg/m L,Vmax=1.419μmol/m L/min。3.关键残基位点的确定利用生物信息学进行分析,通过同源模建技术构建透明质酸酶的三维结构。运用在线评估网站SAVES对模型进行评估,选择最高分模型与底物HA进行对接,结合同源序列比对确定重要的的保守位点,最终选取第79位精氨酸残基作为突变位点,采用全质粒PCR技术进行定点突变,获得突变体R79A。4.突变体R79A酶学性质表征通过还原糖检测法对突变体R79A进行酶学性质表征,其最适反应温度为37℃;最适反应p H为5.0;底物特异性结果显示对硫酸软骨素降解效果优于透明质酸;所有的金属离子都呈现抑制作用,抑制程度二价＞三价＞一价;所测的四种有机溶剂呈现出低浓度抑制,高浓度促进的趋势,其中效果最明显的为二甲基亚砜;以透明质酸为底物,经米氏方程测得动力学参数分别为Km=0.591 mg/m L,Vmax=1.154μmol/m L/min。通过野生型与突变体的酶学性质对比,发现酶的部分性质发生了变化,其中最适反应p H没有明显变化,最适反应温度有微弱的变化,由40℃降低为37℃。对金属离子变得十分敏感,同时降解硫酸软骨素的能力极大提升。通过酶促反应动力学观察发现,突变体Km变大,说明对底物的亲和力减弱,不利于酶与底物的亲核进攻。根据酶活性质的变化推测位于第79位点的精氨酸可能在底物的特异性识别中起到了重要作用。