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细胞质雄性不育(CMS)及其育性恢复是广泛存在于高等植物中的核质互作遗传现象，主要表现为母性遗传的花粉败育以及这种花粉育性缺陷又可被核恢复基因所消除。这种现象不仅为核基因组与细胞质基因组的互作研究提供了模型材料，也是植物杂种优势利用的重要遗传基础。随着杂交水稻成功实现三系配套并在我国大面积推广应用，三系杂交水稻为我国粮食生产做出了巨大贡献，因而对其遗传基础开展深入研究，发掘水稻CMS和育性恢复相关基因并阐明其分子机理具有重要意义。
本研究以非洲栽培稻(Oryza glaberrima Steud.)细胞质籼型雄性不育(AF-CMS)系为母本，非洲栽培稻基因渗入恢复系为父本进行杂交配组，构建B1F1和F2育性分离群体用于CMS恢复基因定位和遗传分析；结合集群分离分析(BSA)和QTL作图两种策略，在第十染色体长臂端中部鉴定获得两个高度连锁的主效恢复基因(QTL)，并对其相应的遗传效应分别进行了探讨。同时，通过对普通栽培稻和普通野生稻品系的线粒体基因组进行从头组装(de novo assembly)和功能注释，分析CMS相关基因在两个物种中的遗传多样性和生物-地理系统进化历程；发掘新的候选CMS胞质和恢复基因来源种质。主要研究结果如下：
1．从127个测配组合(AF-非金A×非洲栽培稻基因渗入系)中筛选出5个组合S1-F1(非金A/S1)、S2-F1(非金A/S2)、S3-F1(非金A/S3)、S4-F1(非金A/S4)和S5-F1(非金A/S5)用于构建育性分离群体。B1F1和F2群体的育性分离比例表明，渗入恢复系S1、S2和S4中可能均分别具有两个独立遗传的主效恢复基因；而S3和S5中的恢复基因则表现为连锁遗传的模式。
2．利用数量性状分离分析(SEA)方法，分别对S1、S2和S4中的恢复基因进行P1、P2、F1和F2的多世代联合分析。结果表明，其中的恢复基因均符合两个主效基因+多个微效基因的混合模型(MX2-ADI-AD)，与利用单个群体的分析结果一致。其中一个主效基因的恢复效应较强，其加性效应值和显性效应值的变幅分别为34.23%～38.20%和21.07%～25.17%；而另一个主效基因的恢复效应较弱，其加性效应值和显性效应值的变幅分别为4.83%～9.90%和-9.57%～-4.35%。此外，两个主效恢复基因间存在明显的互作效应。
3．利用S5-F2群体进行恢复基因的定位分析，结果表明，共筛选获得7对SSR引物和4对Indel引物在双亲间、极端可育和极端不育两个基因池间表现多态性；将渗入恢复系S5中的恢复基因定位于第十染色体长臂端中部；进一步分析表明，目标恢复基因可能直接影响包颈性状。
4．利用S3-F2群体进行恢复基因的定位分析，结果表明，共筛选获得具有多态性的30对SSR引物和3对Indel引物；利用集群分离分析(BSA)和隐性群体分析(RCA)将S3中的恢复基因定位于第十染色体长臂端中部的远着丝粒方向；与RM5373-RM1108等6个标记相距相距1.1cM，与RM25612和RM25716分别相距5.6和9.6cM；进一步分析表明，该区域附近可能存在两个恢复基因。
5．进一步利用ICIM-ADD模型对S3-F2群体进行花粉可育度相关的QTL分析，并与使用复合区间作图法(CIM)和区间作图法(IM)的分析结果一致。结果表明，在第十染色体上定位到两个高度连锁的花粉可育度相关的主效QTL，qPF10-1(LOD=37.239)和qPF10-2(LOD=26.104)，分别位于RM25612至RM6100之间和RM1108至RM25716之间，与BSA方法的定位结果一致。其中qPF10-1的加性和显性效应值分别为30.21%和4.43%，对花粉可育度的贡献率为46.12%；qPF10-2的加性和显性效应值分别为11.02%和41.71%，对花粉可育度的贡献率为42.84%。利用多重区间作图法(MIM)对两个主效QTL的真实性进行验证，结果表明，qPF10-1和qPF10-2均得到了验证，其LOD值分别为4.700和36.255。对目标染色体区域的基因注释分析表明，qPF10-1可能是一个新的PPR蛋白编码基因，也可能是Rf4的等位基因；而qPF10-2则与水稻中已报道的恢复基因均不等位，可以确认为新的CMS恢复基因。
6．对221个普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)和369个普通栽培稻(Oryza sativa L.)品系的线粒体基因组进行了denovo组装。结果表明，平均每个品系的WGS数据中可筛选获得532,662条线粒体基因组来源的reads，相对于线粒体基因组的平均覆盖深度为111.56x；线粒体基因组的平均组装长度为420.00Kb，平均每个品系组装获得113个Contigs，最长Contig的平均长度为72.96Kb。
7．对配子体CMS相关的atp6-orf79同源结构进行发掘，，共鉴定获得16个atp6-orf79的同源单倍型(H1-H16)，其中13个为新发现的单倍型；共鉴定获得11个orf79的等位型(orf79a-orf79k)，其中8个等位型为新发现的orf79等位基因。根据序列相似性，可将atp6-orf79序列注释为4个片段，即atp6编码区、其侧翼序列区(fs)、基因间的非编码区(ncs)和orf79编码区；根据这些单倍型的组成，可将其分为4组：AO-Ⅰ、AO-Ⅱ、AO-Ⅲ和AO-Ⅳ。
8．对16个atp6-orf79单倍型的变异检测表明，共获得18个单核苷酸多态性(SNP)、3个序列长度多态性(9-105bp)和2个短插入(1-4bp)，其中6个SNP发生于orf79编码区，其他变异则均位于fs和ncs区域，atp6编码区表现高度保守而未检测到任何变异。单倍型网络的拓扑分析表明，16个单倍型可明显分为4组，且与根据序列组成的分组结果一致。atp6-orf79单倍型在普通野生稻中的群体基因频率(19.9%)远高于普通栽培稻(8.1%)，且在不同群体中呈现不平衡分布的特点。
9．遗传距离、系统进化树和主坐标分析表明，AO-I、AO-II和AO-III三个分组可能各自具有相对独立的进化途径。其相应的生物-地理分布特征进一步确认了atp6-orf79-like结构具有多中心化的地理分布模式，主要集中分布于南亚(SA)和东亚(EA)区域。进一步利用遗传-空间回归模型，将AO-I的祖先单倍型H1的起源中心定位于南亚恒河平原的东部(23.7°N-27.6°N；86.7°E-90.4°E)；同时，H1的地理中心要素(GCF)坐标、地理中位数中心(GMC)坐标和概率密度空间分布的热点区域亦均位于该地区，进一步确认其为H1的起源中心区域。
10．利用cox3、cox2、rps1等3个线粒体基因的序列多态性，将590个供试材料的细胞质分为3种类型(Or-CT0、Or-CT1和Or-CT2)，其中Or-CT0是最古老的类型，其次为Or-CT1，最晚的为Or-CT2。获得的11个orf79等位型中仅有orf79a和orf79b出现在普通野生稻至普通栽培稻的线粒体基因流中，且均只出现于Or-CT0型的细胞质中。进一步的分析表明，Or-CT0类型的Japonica组中orf79的频率表现极低(3.23%)，远远低于其他分组(23.68%~70%)；而Or-CT0类型的普通野生稻在EA地区亦具有极低的orf79频率(0%)，远远低于其他地区(13.64%~54.55%)；由此表明，Japonica组可能是首先在EA地区(华南地区)中从Or-CT0型普通野生稻中开始驯化，随后在SEA和SA地区与当地的Or-CT0型普通野生稻(O. rufipogon)杂交而继承了其中的orf79基因。
本研究以非洲栽培稻(Oryza glaberrima Steud.)细胞质籼型雄性不育(AF-CMS)系为母本，非洲栽培稻基因渗入恢复系为父本进行杂交配组，构建B1F1和F2育性分离群体用于CMS恢复基因定位和遗传分析；结合集群分离分析(BSA)和QTL作图两种策略，在第十染色体长臂端中部鉴定获得两个高度连锁的主效恢复基因(QTL)，并对其相应的遗传效应分别进行了探讨。同时，通过对普通栽培稻和普通野生稻品系的线粒体基因组进行从头组装(de novo assembly)和功能注释，分析CMS相关基因在两个物种中的遗传多样性和生物-地理系统进化历程；发掘新的候选CMS胞质和恢复基因来源种质。主要研究结果如下：
1．从127个测配组合(AF-非金A×非洲栽培稻基因渗入系)中筛选出5个组合S1-F1(非金A/S1)、S2-F1(非金A/S2)、S3-F1(非金A/S3)、S4-F1(非金A/S4)和S5-F1(非金A/S5)用于构建育性分离群体。B1F1和F2群体的育性分离比例表明，渗入恢复系S1、S2和S4中可能均分别具有两个独立遗传的主效恢复基因；而S3和S5中的恢复基因则表现为连锁遗传的模式。
2．利用数量性状分离分析(SEA)方法，分别对S1、S2和S4中的恢复基因进行P1、P2、F1和F2的多世代联合分析。结果表明，其中的恢复基因均符合两个主效基因+多个微效基因的混合模型(MX2-ADI-AD)，与利用单个群体的分析结果一致。其中一个主效基因的恢复效应较强，其加性效应值和显性效应值的变幅分别为34.23%～38.20%和21.07%～25.17%；而另一个主效基因的恢复效应较弱，其加性效应值和显性效应值的变幅分别为4.83%～9.90%和-9.57%～-4.35%。此外，两个主效恢复基因间存在明显的互作效应。
3．利用S5-F2群体进行恢复基因的定位分析，结果表明，共筛选获得7对SSR引物和4对Indel引物在双亲间、极端可育和极端不育两个基因池间表现多态性；将渗入恢复系S5中的恢复基因定位于第十染色体长臂端中部；进一步分析表明，目标恢复基因可能直接影响包颈性状。
4．利用S3-F2群体进行恢复基因的定位分析，结果表明，共筛选获得具有多态性的30对SSR引物和3对Indel引物；利用集群分离分析(BSA)和隐性群体分析(RCA)将S3中的恢复基因定位于第十染色体长臂端中部的远着丝粒方向；与RM5373-RM1108等6个标记相距相距1.1cM，与RM25612和RM25716分别相距5.6和9.6cM；进一步分析表明，该区域附近可能存在两个恢复基因。
5．进一步利用ICIM-ADD模型对S3-F2群体进行花粉可育度相关的QTL分析，并与使用复合区间作图法(CIM)和区间作图法(IM)的分析结果一致。结果表明，在第十染色体上定位到两个高度连锁的花粉可育度相关的主效QTL，qPF10-1(LOD=37.239)和qPF10-2(LOD=26.104)，分别位于RM25612至RM6100之间和RM1108至RM25716之间，与BSA方法的定位结果一致。其中qPF10-1的加性和显性效应值分别为30.21%和4.43%，对花粉可育度的贡献率为46.12%；qPF10-2的加性和显性效应值分别为11.02%和41.71%，对花粉可育度的贡献率为42.84%。利用多重区间作图法(MIM)对两个主效QTL的真实性进行验证，结果表明，qPF10-1和qPF10-2均得到了验证，其LOD值分别为4.700和36.255。对目标染色体区域的基因注释分析表明，qPF10-1可能是一个新的PPR蛋白编码基因，也可能是Rf4的等位基因；而qPF10-2则与水稻中已报道的恢复基因均不等位，可以确认为新的CMS恢复基因。
6．对221个普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)和369个普通栽培稻(Oryza sativa L.)品系的线粒体基因组进行了denovo组装。结果表明，平均每个品系的WGS数据中可筛选获得532,662条线粒体基因组来源的reads，相对于线粒体基因组的平均覆盖深度为111.56x；线粒体基因组的平均组装长度为420.00Kb，平均每个品系组装获得113个Contigs，最长Contig的平均长度为72.96Kb。
7．对配子体CMS相关的atp6-orf79同源结构进行发掘，，共鉴定获得16个atp6-orf79的同源单倍型(H1-H16)，其中13个为新发现的单倍型；共鉴定获得11个orf79的等位型(orf79a-orf79k)，其中8个等位型为新发现的orf79等位基因。根据序列相似性，可将atp6-orf79序列注释为4个片段，即atp6编码区、其侧翼序列区(fs)、基因间的非编码区(ncs)和orf79编码区；根据这些单倍型的组成，可将其分为4组：AO-Ⅰ、AO-Ⅱ、AO-Ⅲ和AO-Ⅳ。
8．对16个atp6-orf79单倍型的变异检测表明，共获得18个单核苷酸多态性(SNP)、3个序列长度多态性(9-105bp)和2个短插入(1-4bp)，其中6个SNP发生于orf79编码区，其他变异则均位于fs和ncs区域，atp6编码区表现高度保守而未检测到任何变异。单倍型网络的拓扑分析表明，16个单倍型可明显分为4组，且与根据序列组成的分组结果一致。atp6-orf79单倍型在普通野生稻中的群体基因频率(19.9%)远高于普通栽培稻(8.1%)，且在不同群体中呈现不平衡分布的特点。
9．遗传距离、系统进化树和主坐标分析表明，AO-I、AO-II和AO-III三个分组可能各自具有相对独立的进化途径。其相应的生物-地理分布特征进一步确认了atp6-orf79-like结构具有多中心化的地理分布模式，主要集中分布于南亚(SA)和东亚(EA)区域。进一步利用遗传-空间回归模型，将AO-I的祖先单倍型H1的起源中心定位于南亚恒河平原的东部(23.7°N-27.6°N；86.7°E-90.4°E)；同时，H1的地理中心要素(GCF)坐标、地理中位数中心(GMC)坐标和概率密度空间分布的热点区域亦均位于该地区，进一步确认其为H1的起源中心区域。
10．利用cox3、cox2、rps1等3个线粒体基因的序列多态性，将590个供试材料的细胞质分为3种类型(Or-CT0、Or-CT1和Or-CT2)，其中Or-CT0是最古老的类型，其次为Or-CT1，最晚的为Or-CT2。获得的11个orf79等位型中仅有orf79a和orf79b出现在普通野生稻至普通栽培稻的线粒体基因流中，且均只出现于Or-CT0型的细胞质中。进一步的分析表明，Or-CT0类型的Japonica组中orf79的频率表现极低(3.23%)，远远低于其他分组(23.68%~70%)；而Or-CT0类型的普通野生稻在EA地区亦具有极低的orf79频率(0%)，远远低于其他地区(13.64%~54.55%)；由此表明，Japonica组可能是首先在EA地区(华南地区)中从Or-CT0型普通野生稻中开始驯化，随后在SEA和SA地区与当地的Or-CT0型普通野生稻(O. rufipogon)杂交而继承了其中的orf79基因。