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目的：
1．探究MDRPa的医院感染及耐药产生的危险因素，为临床合理选药和防治MDRPa感染提供科学依据；监测我院MDRPa的医院感染情况，为确定院内交叉感染发生及控制提供依据。
2．研究Opr突变或缺失和外排泵类型及高表达在本院MDRPa对碳青霉烯类耐药中发挥的作用；了解高突变菌株的分离情况及氟喹诺酮类抗菌药物的诱导突变情况，探究诱导后铜绿假单胞菌的耐药机制；了解MDRPa的多重耐药性及相关机理。
方法：
1．采用RAPD-PCR技术对本院2009年7月～2010年7月分离的120株MDRPa的同源性进行分析。设病例一对照研究方法，运用t检验、x2检验、非条件Logistic回归等方法分析MDRPa对多重耐药的产生及医院感染的危险因素。
2．采用EDTA双纸片协同试验和EDTA双纸片增效试验检测MDRPa中产金属β内酰胺酶情况，比较两种方法的差异性。改良Hodge试验检测产KPC酶情况。引用KPC、IMP、VIM、SPM、GIM、Opr等基因的引物，测定相应的耐药基因携带情况。RealtimeRT-PCR检测OprD相对表达量，SDS-PAGE电泳半定量分析其蛋白质表达量；测序比对部分耐药菌株的Opr全序列。
3．RealtimeRT-PCR测定MexB、MexD、MexXmRNA的相对表达量及测序调控基因mexR和nalC;外排泵抑制剂CCCP联合抗生素使用检测MDRPa的MIC变化。
4．采用高浓度利福平耐药生长试验检测多重耐药菌株和全敏感菌株的突变体及突变频率。测定低浓度肉汤传代诱导对环丙沙星的耐药能力及诱导后相关耐药基因的突变情况。
5．PCR检测MDRPa的整合酶、氨基糖苷类钝化酶及超广谱β内酰胺酶等相关基因。
结果：
1.120株MDRPa同源性分析共分16个基因型，主要包括6个克隆株；患者住院科室、使用呼吸机、感染前住院天数、性别和使用三代头孢、支气管灌洗、机械通气、碳青酶烯类及酶抑制剂类抗生素等与铜绿假单胞菌多重耐药性有关，主要有支气管灌洗和机械通气(OR值分别为13.944，15);MDRPa对各类抗菌药物的耐药产生危险因素各不相同：亚胺培南耐药产生危险因素主要为ICU和神经外科病房(OR值分别为22、14.667);头孢哌酮/舒巴坦耐药产生危险因素包括住院天数为80-104天及＞105天和ICU病房(OR值分别11.083、12.667、25)。
2．EDTA双纸片协同试验检测到28株阳性，阳性率为47.45％;EDTA双纸片增效试验检测到29株阳性，阳性率为49.15％，两种方法间没有显著性差异(x2=2.131，P=0.144)；PCR检出2株IMP-1阳性，未检测到KPC、GIM、SPM和VIM等基因；OprD缺失7株；Opr中碱基突变主要集中在1010-1136bp和1212-1355bp区域，此区域各碱基位点的突变频率各不相同，且与表达量之间没有直接的相关性。
3.30株MDRPa均存在MexB和MexD，仅有20株存在MexX,其中高表达MexB、MexD和MexX分别有30株、25株和6株；MexB高表达株与抗菌药物TET、CIP、GEN的MIC值变化有着密切关系(P分别为0.045、0.002、0.031)，但与CTX的MIC值变化没有确切的相关性(P=0.538);TET、CIP、GEN、CTX联合EPI前后MIC变化四者之间差异有统计学意义(x2=25.265，P=0.003)。两两比较经“行×列”x2分割法设定检验水准α’=0.0071，发现CTX和CIP两者之间MIC变化分布差异无统计学意义(x2=7.842，P=0.049)，CTX和GEN两者之间MIC变化分布差异有统计学意义(x2=10.299，P=0.006)，CTX和TET两者之间MIC变化分布差异有统计学意义(x2=19.195，P=0.000)，而TET、CIP、GEN三者两两之间差异均无统计学意义。选取10株MexB高表达株测序mexR和nalC:有1株同时发生了mexR378T→A替代和nalC279G→A替换、755T缺失，有5株发生nalC279G→A替换和755T缺失，有1株发生了nalC279G→A、721A→T替换，1株仅发生了nalC279G→A。
4．多重耐药菌株的突变频率显著高于全敏感菌株(U=-4.603，P=0.000)；诱导结果显示28株对左氧氟沙星耐药，其中6株被诱导成多重耐药菌株；诱导后突变频率明显高于诱导前(t=-2.57，P=0.01);诱导后耐药机制：6株发生gyrAThr83(ACC)→Ile(ATC)位点突变，未发现par突变；诱导后MexB、MexD、MexX表达上调的分别有15株、17株、5株(3株超高表达)。选取8株MexAB-OprM高表达株测序mexR和nalC，1株mexR突变，8株nalC突变。
5.35株携带有Ⅰ类整合酶基因，都伴有qacE△l-Sull，共有9种不同类型基因盒；106株AmpC‘酶阳性，ESBL包括CARB20株、OXA-1015株、PER-13株、CTX-M5株；大部分菌株均产生氨基糖苷钝化酶包括乙酰转移酶(AAC):aac3Ⅱ96株，ant6169株，aac3Ⅳ27株，aac(6″)Ⅱ10株；核苷转移酶(ANT):ant2″I23株，ant3″Ⅱ12株，aac3120株，ant(3")19株，rmtB7株，armA8株；发生gyrA突变28株，par突变35株；质粒Qnr均为阴性；
结论：
1．本院多重耐药菌主要有6种流行克隆株，MDRPa医院感染可能与分离出MDRPa14天内使用碳青霉烯类、三代头孢菌素及酶抑制剂类抗菌药物、机械通气、气管插管及切开、支气管灌洗、基础疾病、住院时间长短等密切相关，其对各类抗菌药物的耐药危险因素也各不相同。
2.OprD2蛋白的突变或表达量降低和外排泵的高表达是我院MDRPa碳青霉烯类耐药的主要机制，极少部分菌株通过产酶机制导致耐药。突变位点多态性分析发现碱基突变主要集中在碱基1010-1136bp和1212-1355bp区域，此区域各碱基位点的突变频率各不相同，且与表达量之间没有直接的相关性，并发现部分新的碱基突变位点。
3．主动外排系统在我院MDRPa表达率很高，外排泵MexAB-OprM普遍高表达是此菌多重耐药机制之一：其高表达与调控基因mexR、nalC发生变异有关，同时存在其他调控机制。MexAB-OprM高表达菌株与抗菌药物TET、CIP、GEN的MIC值变化有着密切关系。
4．多重耐药菌的突变频率很高，全敏感临床分离株环丙沙星诱导后突变频率明显增高，且可呈现多重耐药性，耐药机制主要以外排泵高表达、gyrA突变以及OprD突变。
5．本院MDRPa耐药机制复杂多样，携带多种耐药基因，研究揭示产生AmpC酶、CARB、OXA型ESBL、aac(3)11、ant6I及aac3Ⅳ氨基糖苷钝化酶、发生gyrA和par突变，以及OprD2蛋白突变缺失和外排泵高表达是造成铜绿假单胞菌对临床常用的第三、四代头孢菌素、酶抑制剂复方制剂、氟喹诺酮类、碳青霉烯类和氨基糖苷类多重耐药的重要原因。部分菌株携带Ⅰ类整合子，导致耐药性播散。