【摘 要】
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神经病理性疼痛是一种慢性疼痛,全球发病率逐年升高,临床特征主要为痛觉的过敏、超敏和自发性疼痛。其发病机制包括神经损伤引起的离子通道改变、炎症反应、外周和中枢敏化等。有研究发现瞬时受体电位香草酸亚型1（Transient Receptor Potential Vanilloid 1,TRPV1）广泛分布于神经系统中,在神经病理性疼痛的病程中发挥重要作用。TRPV1被激活后,可介导痛觉的产生或增敏,是
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神经病理性疼痛是一种慢性疼痛,全球发病率逐年升高,临床特征主要为痛觉的过敏、超敏和自发性疼痛。其发病机制包括神经损伤引起的离子通道改变、炎症反应、外周和中枢敏化等。有研究发现瞬时受体电位香草酸亚型1（Transient Receptor Potential Vanilloid 1,TRPV1）广泛分布于神经系统中,在神经病理性疼痛的病程中发挥重要作用。TRPV1被激活后,可介导痛觉的产生或增敏,是炎症和疼痛的有效靶点。目前,TRPV1通道已成为开发安全有效、无耐受性新型镇痛药的重要分子靶标之一,为炎症、神经疾病和癌症相关疼痛的治疗提供新的思路和方向。温经止痛是中医治疗疼痛的重要治法。干姜系温里药之主药,具有温中散寒止痛的功效,临床被广泛用于缓解各种疼痛,如头痛、风湿病疼痛、牙痛和毒蛇咬伤。然而,人们对干姜的镇痛作用及其分子机制仍知之甚少。8-姜烯酚（8-shogaol,8S）是干姜的有效抗炎成分。本课题拟从体内和体外研究8-姜烯酚对神经病理性疼痛的镇痛作用,并基于TRPV1通道探讨其可能的镇痛机制,为从干姜中开发新型镇痛药物奠定药理学基础,也为干姜散寒止痛科学内涵的诠释提供支撑。目的:研究8-姜烯酚对神经病理性疼痛的治疗作用并探讨其可能的机制。方法:1.8-姜烯酚对神经病理性疼痛的药效学研究:体内采用坐骨神经慢性缩窄手术（chronic constriction injury,CCI）建立神经病理性疼痛小鼠模型,通过行为学、免疫荧光、PCR、WB、ELISA技术检测小鼠疼痛阈值（机械痛、热痛）、组织病理变化、促炎细胞因子水平研究8-姜烯酚的镇痛效应。体外采用LPS/ATP诱导神经母瘤细胞（Neuro-2a,N2a）建立神经炎症损伤细胞模型,通过MTT、ELISA、PCR、免疫荧光等技术检测细胞生存率、胞内Ca2+水平、胞外LDH、IL-1β含量和细胞死亡量,研究8-姜烯酚的神经保护作用。2.8-姜烯酚缓解神经病理性疼痛的机制研究:体内通过行为学、WB、PCR技术检测CCI小鼠脚掌皮下注射TRPV1激动剂Capsaicin（CAP）后行为学和TRPV1-NLRP3通路表达的变化初步探索8-姜烯酚的镇痛机制。体外首先通过钙成像、膜片钳和WB技术检测转染TRPV1的HEK293T细胞内电流变化和钙荧光分析8-姜烯酚对TRPV1功能和表达的影响。其次运用PCR、免疫荧光等技术检测给予N2a细胞CAP和TRPV1抑制剂（A-1165442,A1l）后细胞内Ca2+水平、胞外LDH水平和TRPV1-NLRP3通路相关蛋白和基因的表达,分析TRPV1-NLRP3通路在神经损伤中的作用。最后通过ELISA和PCR检测8-姜烯酚对LPS/ATP刺激的N2a细胞中TRPV1-NLRP3通路的表达,探讨8-姜烯酚缓解神经病理性疼痛的作用机理。结果:1.体内药效学结果显示1 mg/kg和10mg/kg剂量8-姜烯酚均可显著提高CCI小鼠的机械痛阈值和热痛觉阈值,有效改善CCI小鼠背根神经节（dorsal root ganglia,DRG）组织的炎性浸润,下调血清IL-1β、TNF-α含量和DRG组织IL-1β、TNF-α的表达,且10 mg/kg剂量治疗效果更佳。体外药效学结果显示8-姜烯酚可显著提高LPS/ATP诱导的N2a细胞的生存率,降低细胞内Ca2+水平、胞外LDH、IL-1β含量以及细胞的死亡量。2.体内机制研究结果显示1 mg/kg和10 mg/kg 8-姜烯酚均可显著降低CCI小鼠DRG组织中TRPV1、NLRP3、Caspase-1、ASC mRNA和蛋白的表达。CAP显著削弱10 mg/kg 8-姜烯酚对CCI小鼠的机械痛、热痛阈值的提高和对DRG组织TRPV1-NLRP3通路的下调作用。体外机制研究结果显示8-姜烯酚可直接作用于TRPV1,促进内向电流,诱导HEK293T细胞内钙荧光短暂急剧的升高,同时可降低TRPV1-HEK293T细胞中TRPV1蛋白的表达。CAP 可促进 LPS/ATP 诱导的 N2a 细胞 TRPV1、NLRP3、Caspase-1、ASC mRNA表达、细胞Ca2+水平和LDH含量的升高,加重细胞损伤;A-1165442可抑制TRPV1-NLRP3通路基因表达、细胞Ca2+水平和LDH含量的升高缓解细胞损伤。8-姜烯酚可显著下调N2a细胞中 TRPV1、NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β mRNA 的表达。结论:8-姜烯酚可有效缓解神经病理性疼痛,其镇痛机制可能与TRPV1-NLRP3通路有关。
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