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自2019年12月首次报告住院病例以来,截至2022年5月,新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019,COVID-19）全球报告确诊病例数已超过5.2亿,并造成超过600万人死亡。新型冠状病毒肺炎（简称“新冠肺炎”）是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）感染所致。虽然世界各国积极推进新冠肺炎疫苗的接种,但是SARS-CoV-2变异株频繁出现,原始毒株疫苗的保护效果针对不同病毒突变株出现不同程度的下降。除疫苗外,各国亦致力于抗病毒药物的研发,其中抗体类药物可识别和中和病毒且副作用相对较弱,因此,中和抗体的研发在新冠肺炎疫情爆发后即受到广泛关注。来自美洲驼或羊驼的天然重链抗体重链可变区（variable domain of heavy chain of heavy chain-only antibody,VHH）,其分子量仅为 15kDa 左右,因此,VHH 也被称为纳米抗体（nanobody,Nb）。尽管VHH大小仅为免疫球蛋白G（Immunoglobulin G,IgG）的十分之一,但VHH的特异性和亲和力与IgG相似。因其与人重链可变区（heavy chain variable domains,VH）结构域家族 Ⅲ（VH domains of family Ⅲ,VH3）序列具有高度同源性,VHH被认为在人体中免疫原性较低。此外,与IgG相比,纳米抗体具有更高的溶解度和温度稳定性,并且更容易被克隆和表达。因此,纳米抗体已被开发用于包括SARS-CoV-2在内的病原体感染的治疗。与免疫美洲驼或羊驼构建免疫文库不同,全合成纳米抗体文库可省去动物免疫周期,直接用于纳米抗体的筛选。在本课题中,我们以羊驼VHH,NbBcII10为骨架,对VHH的3个互补性决定区（complementarity-determiningregion,CDR）进行随机化设计,根据天然抗体 CDR氨基酸组成偏好,通过Trimer Codon技术分段合成覆盖3个CDR的引物,其中CDR3设计6、9和16氨基酸三种长度,通过重叠延伸（overlap）PCR合成随机化VHH基因片段,构建纳米抗体文库。通过鉴定,该合成纳米抗体文库的库容量达到5×109,正确率大于90%,满足抗体筛选的需要。我们采用噬菌体展示技术,利用SARS-CoV-2受体结合域（receptor binding domain,RBD）重组蛋白进行中和抗体筛选。首先,我们使用SARS-CoV-2 WH01株（wild type,WT）RBD进行四轮富集筛选,获得1A3、1A7和1A8三株中和抗体,但抗体原核表达效率较低。将纳米抗体与人IgG可结晶段（fragment crystallizable,Fc）结构域融合后,通过真核表达系统成功获得1A7-Fc和1A8-Fc抗体,假病毒中和试验证明1A7-Fc可中和WT株和Delta变异株;1A8-Fc可中和WT株、Beta等变异株。随后,我们使用WT株RBD和Beta变异株RBD进行交替筛选以期获得具有广谱中和活性的纳米抗体。我们获得2A2和2A4两株中和活性较好的中和抗体,融合人IgGFc后,在Beta等变异株假病毒的半数最大抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration,IC50）均低于1nM,但不能中和Delta突变株。通过对比上述抗体的中和谱发现,1A8、2A2和2A4的中和谱一致,其中2A4中和活性最高,且与1A7中和谱互补,两株抗体组合可能获得更加广谱的中和抗体。在1A7和2A4组合表达前,我们通过体外亲和力成熟,进一步提高抗体的中和活性,获得1A73和2A41两株抗体。1A73对不同株假病毒中和活性较1A7提高了 5-20倍;2A41对不同株假病毒中和活性提高了 1-60倍。我们利用生物膜干涉层析实验（Biolayer interferometry,BLI）对 1A73-Fc 和 2A41-Fc 结合 RBD 的特征进行分析,发现1A73-Fc和2A41-Fc与WT RBD结合存在竞争关系,而针对Beta和Delta RBD不存在竞争关系。将1A72和2A41构建为异源双互补位（Bi-paratopic）抗体后,2A41-1A73-Fc（4-7-Fc）能够中和所有的关切的变异株（Variants of concern,VOC）和关注的变异株（Variants of interest,VOI）突变株假病毒,且IC50均低于1nM。活病毒中和试验发现 4-7-Fc 中和 WT、Beta、Delta、Omicron（BA.1）活病毒上的 IC50 均低于 1nM。我们构建了 RBD上单点突变的假病毒共计52株,包括流行突变株上已存在的突变位点以及对康复者血清或抗体发生免疫逃逸的突变位点。通过假病毒中和试验发现,E484、S494是1A73的关键识别位点,Y449,L452是2A41的关键识别位点,4-7-Fc能够中和所有我们构建的RBD单点突变假病毒,提示具有广谱中和活性。综上所述,本研究通过全合成纳米抗体文库筛选和体外亲和力成熟获得2株（1A73、2A41）识别SARS-CoV-2 RBD上不同表位的具有较高亲和力和中和活性的纳米抗体。两株抗体组合构建的Bi-paratopic抗体,具有广谱中和活性,可有效中和WT、Beta、Delta、Omicron（BA.1）活病毒,且可能在一定程度上抵抗病毒的免疫逃逸,具有一定的应用前景。本研究有助于拓宽SARS-CoV-2高亲和力中和抗体开发思路,为当前针对SARS-CoV-2 Omicron突变株（BA2、BA3、BA4/5等）的中和抗体的快速开发提供参考。