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乳腺癌是中国女性最常患的癌症之一,其发病率居女性全部恶性肿瘤第一位,远高于世界平均水平,且逐年呈明显上升趋势。乳腺癌的治疗手段目前以外科手术、化学治疗、放射治疗、内分泌治疗等为主,但手术治疗复发率高,放化疗、内分泌治疗毒副作用强,因此探索新的乳腺癌治疗方法刻不容缓。光动力疗法(PDT)是一种局部微创的抗肿瘤疗法,PDT通过特定波长的光源激发肿瘤部位的光敏剂,产生大量活性氧簇(ROS),以氧化肿瘤部位的生物大分子,改变肿瘤微血管通透性,并且对肿瘤细胞膜造成直接破坏,诱导肿瘤细胞凋亡或坏死。PDT具有对患者创伤小、光源靶向性、可重复治疗、无耐药性等优点。但是,目前市售的光敏剂受自身理化性质影响,水溶性差而容易在体内形成聚集体影响激发的过程及单线态氧的产生;在肿瘤组织分布缺乏靶向性易引起光毒性作用;激发光波长多为可见光导致治疗深度浅,因此,常规PDT主要用于浅表肿瘤治疗。研究表明,PDT对肿瘤细胞除有直接杀伤作用外,还可以通过产生急性炎症反应、增强肿瘤免疫原性、活化细胞毒性T细胞(CTL)等途径,初步激发抗肿瘤免疫反应,诱导肿瘤的免疫原性死亡(ICD)。CTL是杀伤肿瘤的重要免疫细胞,但由于肿瘤微环境中的CTL高表达细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)和程序性死亡受体-1(PD-1)等抑制性受体,其杀伤肿瘤的活性常受到抑制,导致多数免疫治疗效应减弱,残存的肿瘤细胞和已转移的肿瘤细胞发生免疫逃逸。可喜的是,近年来利用单克隆抗体作为免疫检查点抑制剂,可以阻断相应的CTL抑制信号,促进其活化,使其重获对肿瘤细胞的杀伤活力。基于此,本文创造性地利用基于活性氧响应胶束的的双光子光动力疗法联合免疫检查点疗法,激发并提高全身抗肿瘤免疫效应。首先,设计了一种聚乙二醇修饰的树枝状高分子聚合物,用以同时包埋光敏剂和双光子化合物以提高两者水溶性,且此纳米载药系统对ROS敏感,能通过EPR效应靶向肿瘤细胞,利用肿瘤细胞内的高ROS浓度和2PA-PDT过程中产生的ROS,迅速释放药物;其次,该载药系统搭载的新型强双光子吸收化合物,可被穿透力强的近红外激光激发并通过荧光共振能量转移进一步激发光敏剂,延伸PDT的穿透深度;最后,通过双光子光动力疗法杀伤深度肿瘤组织的同时,造成病灶局部的急性炎症并诱导肿瘤ICD,再联合免疫检查点抑制剂活化被抑制的CTL,增强“远位效应”进一步激发机体免疫反应,抑制肿瘤生长及转移,并减轻治疗过程中对机体的损伤。实验首先合成了ROS敏感的支化大分子pHPMA-CA-mPEG,并利用体积排阻色谱法(SEC)对聚合物进行表征。接着采用薄膜水化法制备同时包埋光敏剂和双光子化合物的载药胶束(CLM),并根据载药量、包封率、FRET效率对其进行了优化,综合应用激光粒度仪、透射电镜、紫外分光光度计、荧光光谱仪等对CLM的粒径、电位、形貌、稳定性、临界胶束浓度、双光子吸收截面积、单线态氧产率、体外释放度等进行了测定。然后,以小鼠4T1乳腺癌细胞为模型,利用CCK-8法检测了CLM对细胞的暗毒性和光毒性,并通过双光子共聚焦显微镜考察细胞对CLM的摄取以及实时2PA-PDT后细胞内ROS水平等,并进一步采用免疫荧光法(IF)和流式细胞术(FCM),检测细胞表面钙网蛋白(CRT)在2PA-PDT后的表达。建立Balb/c小鼠原位4T1乳腺癌模型进行抗癌活性研究,通过小动物活体成像仪评价了CLM的靶向性,以抑瘤率和肺部转移情况为指标,对双光子光动力疗法联合免疫疗法进行了药效学考察,并评价其毒副作用。结果显示,通过RAFT聚合制备的ROS响应型聚合物可以共包载双光子化合物Tb以及光敏剂PPa,制得的载药胶束CLM粒径在110 nm左右,呈现均匀的球形;优化后Tb和PPa的包封率均高于75%;冷藏条件下该胶束在一周内具有较好的稳定性;CLM在808 nm处的双光子截面积为300(37)/GM左右,且在该波长激光照射后具有较好的单线态氧产率;体外释放结果显示CLM释药呈ROS依赖性,能在808 nm激光照射下快速释放药物。在4T1细胞模型上,CLM可以被迅速摄取,载药胶束在20μM浓度范围内无明显细胞暗毒性,近红外激光照射3 min后细胞存活率下降到25%;IF和FCM结果显示细胞表面的CRT表达随NIR光照强度增强而明显增加。乳腺癌原位小鼠模型在尾静脉注射CLM后,24 h左右肿瘤部位蓄积量最大,体内抗肿瘤结果表明,基于CLM的靶向2PA-PDT联合免疫检查点抑制剂α-PD-1可以明显抑制原位乳腺肿瘤的生长及肺部转移,抑瘤率达到66%。治疗组小鼠体重在观测期间无明显变化,治疗结束后主要器官均无明显异常。综上所述,该ROS响应的纳米胶束递药系统能实现靶向的双光子光动力治疗,激活局部免疫反应,联合免疫检查点疗法后能进一步增强药效,有望为乳腺癌的靶向治疗提供新的思路和策略。