论文部分内容阅读
目的:本研究通过高脂饲料喂养加颈动脉内膜空气干燥术的方法构建兔颈动脉粥样硬化模型。分别观察蛭龙活血通瘀胶囊、阿托伐他汀钙片及蛭龙活血通瘀胶囊和阿托伐他汀钙片混合用药对实验兔血脂的影响及相关病理改变;并通过对调节性T细胞的炎症下游分子研究,观察其对病灶中细胞增殖及炎症的抑制作用;探讨基于TGF-β∕Smads通路蛭龙活血通瘀胶囊对颈动脉粥样硬化的改善作用。方法:1、将50只新西兰大白兔适应性喂养1周后按随机数字表法随机分为5组,即正常对照组(n=10)、模型组(n=10)、蛭龙活血通瘀胶囊组(n=10)、阿托伐他汀钙片组(n=10)、蛭龙活血通瘀胶囊+阿托伐他汀钙片混合用药组(n=10)。1周后除正常组普通饲料喂养外,其余四组均采用高脂饲料喂养。并于1周后行右侧颈动脉内膜空气干燥术,术后继续高脂饲料喂养以建立兔颈动脉粥样硬化模型。术后1周正式给药,分别予以:蛭龙活血通瘀胶囊组3.12 g生药/kg/d、阿托伐他汀钙片组0.51 mg/kg/d、混合用药组3.12 g生药/kg/d+0.51 mg/kg/d,每组每只配以等量(4 mL∕kg)生理盐水灌胃。单笼喂饲,饮水不限,每只实验兔每日进食150 g饲料。2、各组实验兔药物干预4周后,麻醉后心脏取血收集血清标本。每组各随机选取7例血清标本,使用全自动生化分析仪分别测定其甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇的浓度。再每组各随机选取3例标本,采用酶联免疫吸附试剂法(ELISA)分别测定其TGF-β1、IL-10、IL-6、IL-17的表达水平。3、采血完成后用空气栓塞法处死所有动物,取右侧颈总动脉行常规石蜡包埋后制备HE染色切片,观察各标本组织病理改变。4、每组各随机选取3例颈动脉组织标本,利用蛋白印迹法(Western Blot)分别测定各组标本中Foxp3、MMP-2、MMP-9的蛋白表达;并采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测各组标本中TGF-β1、Foxp3、IL-10、MMP-2、MMP-9 mRNA的含量。5、所有实验数据采用Graphpad prism 8.0.1软件统计分析,均以均值±标准差(sx±)表示,多组间比较采用单因素方差分析Tukey’s多重检验,以P<0.05为有统计学意义。结果:1、实验过程相对顺利,整个实验过程未出现死亡病例。2、血脂水平:模型组较正常对照组各血脂指标均显著升高,具有统计学意义(P<0.001);各用药组实验兔经药物干预后,血脂水平均有不同程度改善,以P<0.05或P<0.01或P<0.001具有统计学意义。3、病理结果:光镜下所见:正常组实验兔颈动脉管壁各层结构清晰,未见脂质沉积及颈动脉粥样硬化斑块;模型组实验兔颈动脉内膜增生严重,管腔内可见明显的斑块形成,斑块内可见薄层的纤维帽及脂质核心,泡沫细胞聚集及炎性细胞浸润,中外膜不规则增厚,表明在造模后实验兔颈动脉管壁各层组织受到一定损伤,符合CAS病理学改变;蛭龙活血通瘀胶囊组及阿托伐他汀钙片组实验兔颈动脉内膜增厚程度较模型组减轻,可见内皮部分隆起,具有薄斑块,少量泡沫细胞及炎性细胞浸润,中外膜不同程度增厚;混合用药组实验兔内皮细胞形态尚完整,但仍有轻微的内膜增生,可见部分炎性细胞。4、ELISA结果:较正常组,模型组实验兔TGF-β1和IL-10水平显著降低,IL-6和IL-17水平显著上升,具有统计学意义(P<0.01)。经过蛭龙活血通瘀胶囊或阿托伐他汀钙片单独干预后,各实验兔IL-6、IL-17水平均有不同程度下降,IL-10水平有所上升,与模型组相比具有统计学意义(P<0.01);TGF-β1在蛭龙活血通瘀胶囊组有所上升,而在阿托伐他汀钙片组变化不明显;而经中西药物组联合干预后,上述各项指标改善情况均较单药物组更为明显。5、Western Blot结果:与正常组相比,模型组Foxp3蛋白表达显著降低,MMP-2、MMP-9蛋白表达显著增加,具有统计学意义(P<0.01);经蛭龙活血通瘀胶囊或阿托伐他汀钙片单独干预后,Foxp3蛋白表达有所增加,而MMP-2蛋白水平有所下降,与模型组相比,具有统计学意义(P<0.05);MMP-9蛋白水平在蛭龙活血通瘀胶囊组显著降低(P<0.05),而在阿托伐他汀钙片组无显著变化;但当中西药物组联合干预后,上述三种蛋白变化趋势均较单药物组更为明显。6、RT-PCR试验结果:模型组Foxp3、TGF-β1、IL-10 mRNA水平相对于正常组显著降低,而MMP-2和MMP-9 mRNA水平显著升高,具有统计学意义(P<0.01);经蛭龙活血通瘀胶囊或阿托伐他汀钙片单独干预后,Foxp3、TGF-β1、IL-10 mRNA水平均有不同程度的升高,而MMP-2、MMP-9 mRNA水平有所下降,与模型组相比,具有统计学意义(P<0.05);经中西药物组联合干预后,上述五种基因的mRNA水平变化更为显著,具有统计学意义(P<0.01)。结论:1、蛭龙活血通瘀胶囊可通过降低血脂水平来改善动脉粥样硬化。2、蛭龙活血通瘀胶囊可通过TGF-β∕Smads通路刺激Foxp3促进调节性T细胞的分化成熟,免疫抑制相关效应性T淋巴细胞,促使该通路下游抗炎因子IL-10和TGF-β1水平升高,促炎因子IL-17、IL-6水平下降,从而减轻机体局部的炎症和免疫反应,稳定易损斑块,改善动脉粥样硬化。3、蛭龙活血通瘀胶囊可通过TGF-β∕Smads通路参与炎症细胞抑制MMP-2、MMP-9的表达,减少细胞外基质降解,稳定易损斑块。