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研究背景:皮肤是人体的屏障,对维持内环境稳态至关重要。一旦皮肤受到外界危险因素的损害造成皮肤缺损,机体就会立即启动创面愈合进程,尽快封闭皮肤缺损,以维持机体的稳态。任何因素阻碍创面愈合的正常进行就会导致创面延迟愈合或者不愈合,形成慢性不愈合创面,给患者带来沉重的负担。因此,保证创面愈合的正常进行至关重要。创面愈合由多种细胞相互协作,其中,表皮干细胞（Epidermal stem cells,ESCs）在创面愈合的过程中发挥着重要作用。但是在慢性创面中,由于铁过载,氧化应激的水平升高,进而导致ESCs脂质过氧化水平的升高,影响ESCs正常功能的执行,阻碍创面愈合的进程。因此,探究影响ESCs脂质过氧化水平的关键因子,阐明ESCs在铁依赖的氧化应激条件下的自我保护机制,可以为临床促进创面愈合提供新的思路。研究目的:探究在不同浓度的全铁转铁蛋白的培养条件下ESCs的差异表达蛋白,并寻找关键因子,研究其对ESCs功能特别是对其脂质过氧化水平的影响。研究方法:1.小鼠ESCs的提取与鉴定从新生小鼠的皮肤中通过Ⅳ型胶原黏附法提取ESCs。通过倒置相差显微镜观察提取培养的ESCs的正常形态并通过Western blot分析、流式细胞术和免疫荧光技术对ESCs的标志物CK14、CK15、p63和CK10进行鉴定。2.全铁转铁蛋白浓度变化对ESCs内Fe2+及脂质过氧化水平的影响将ESCs置于加入不同浓度（0 μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100 μg/mL和 1 mg/mL）的全铁转铁蛋白的培养基中培养两天,通过流式细胞术测定不同培养条件下的ESCs的Fe2+及脂质过氧化水平。3.TMT定量蛋白质组学分析差异表达蛋白将ESCs置于不含全铁转铁蛋白和含有100μg/mL全铁转铁蛋白的培养基中培养两天,通过TMT定量蛋白质组学分析,筛选差异表达蛋白并寻找关键蛋白。Western blot分析验证其表达。4.腺病毒转染ESCs实现ACOT7的过表达分别用空载体腺病毒和携带Acot7的腺病毒转染ESCs,作为空载体对照组和过表达实验组。并用Western blot分析和免疫荧光技术验证病毒转染效率。5.过表达ACOT7对ESCs增殖和凋亡的影响使用IncuCyte S3活细胞分析系统检测并分析细胞增殖能力,研究ACOT7对ESCs增殖能力的影响。通过Annexin V-PE/7-AAD染色结合流式细胞术检测细胞凋亡,研究ACOT7对ESCs凋亡功能的影响。6.过表达ACOT7对ESCs脂质过氧化水平及细胞存活率的影响将ESCs置于 H2O2、Erastin 和 RSL3 的刺激下 6h,使用丙二醛（Malondialdehyde,MDA）检测试剂盒和流式细胞术分别测定ESCs中MDA的含量及脂质过氧化水平,研究ACOT7对ESCs脂质过氧化的影响。通过CCK-8法测量H2O2、Erastin和RSL3的刺激对ESCs细胞活力的影响,研究过表达ACOT7对ESCs存活率的影响。7.统计学分析以上实验数据使用GraphPad Prism 8.0.1版软件进行统计分析,定量数据以均值±标准差表示。通过使用非配对t检验来比较组间的差异,其中P＜0.05代表结果有统计学意义。研究结果:1.小鼠ESCs的形态与鉴定ESCs在镜下排列紧密,整体呈“铺路石样”;细胞形态呈不规则样多边形。提取所获得的细胞高表达CK14、CK15和p63并且很少表达CK10,这表明了实验所用的ESCs的纯度良好。2.全铁转铁蛋白浓度变化对ESCs内Fe2+及脂质过氧化水平的影响随着培养基中全铁转铁蛋白浓度的增加,ESCs中Fe2+的水平呈现出升高的趋势,脂质过氧化水平没有明显差异。每组ESCs分别给予500 μM H2O2刺激6 h,ESCs的脂质过氧化水平仍然没有明显差异。3.TMT定量蛋白质组学分析差异表达蛋白通过蛋白质组学分析,筛选出差异表达蛋白ACOT7。Western blot分析证实ACOT7、FTH、FTL的表达水平与培养基中全铁转铁蛋白的浓度呈正相关。4.腺病毒转染ESCs实现ACOT7的过表达构建ACOT7的过表达腺病毒载体并将其转染到ESCs中,Western blot分析和免疫荧光证实了转染效率符合实验的需求。5.过表达ACOT7对ESCs增殖和凋亡功能的影响细胞增殖实验和细胞凋亡实验证实过表达ACOT7对ESCs的增殖功能和凋亡功能没有影响。6.过表达ACOT7对ESCs脂质过氧化水平及细胞存活率的影响在H2O2、Erastin和RSL3的刺激下,过表达ACOT7可以降低ESCs中MDA的水平并抑制脂质过氧化,进而提高ESCs的存活率。研究结论:随着培养基中全铁转铁蛋白浓度的增加,ESCs中Fe2+的水平升高,ACOT7的表达增加。过表达ACOT7可以降低ESCs的脂质过氧化水平并且提高细胞存活率,为减轻因创面氧化应激对ESCs造成的不利影响以及促进创面愈合提供了新的思路。