目的:TMEM16A作为钙激活氯通道（Ca CCs）的分子基础,在人体分布广泛,具有钙依赖性调阴离子渗透等多种细胞功能并参与腺体分泌、平滑肌与骨骼肌收缩、疼痛、高血压、动脉粥样硬化、肿瘤等生理和病理过程。对于TMEM16A结构-功能关系的深入研究,发现潜在分子生物学靶点,将有望促进相关疾病治疗的发展。本研究通过深入研究TMEM16A钙激活氯电流,探讨剪切力和胆固醇对TMEM16A通道的调节机制,旨在探索剪切力和胆固醇对TMEM16A钙激活氯通道的具体作用机制,寻找相关的结合位点及其结合方式。进而阐明剪切力通过胆固醇对TMEM16A的调节机制。本课题研究成果为进一步阐明TMEM16A通道的调节机制,开发作用于TMEM16A的药物具有非常重要的指导意义。实验方法:本研究选择在HEK 293细胞内转染TMEM16A（m TMEMl6A-EGFP质粒）,用Western blot等实验方法,结合全细胞膜片钳技术,检测和记录剪切力对TMEM16A钙激活氯电流的作用;通过应用MβCD（methyl-β-cyclodextrin）去除胆固醇,检测剪切力对HEK细胞上的TMEM16A钙激活氯电流的作用是否改变。之后,验证胆固醇对TMEM16A的作用,通过粗粒化动力学模拟选取胆固醇敏感位点K588、Y593、V599、K755、W760、Y761、L764,定点突变得到TMEM16A的突变体质粒,全细胞膜片钳技术检测与TMEM16A相比,加入胆固醇后TMEM16A突变体的钙激活氯电流是否变化,记录并分析电流,以此得到可信度最高的胆固醇结合位点,即调控胆固醇作用于TMEM16A的关键氨基酸。研究结果:全细胞膜片钳记录模式下,剪切力抑制在人胚肾细胞HEK293T细胞系中转染的TMEM16A钙激活氯电流;去除胆固醇抑制程度减小;胆固醇直接抑制TMEM16A钙激活氯电流,20μmol/L浓度的水溶性胆固醇对TMEM16A电流抑制率可达40～50%。通过粗粒化动力学模拟大致选取的七个待证实的胆固醇敏感位点中,胆固醇对突变K588氨基酸得到的TMEM16A K588A突变体的钙激活氯电流抑制作用明显减小。研究结论:剪切力通过胆固醇抑制TMEM16A钙激活氯电流。胆固醇是通过结合位点K588与TMEM16A结合,该位点位于TMEM16A第五跨膜区域。