研究目的近年来,慢性肾功能不全发病率逐年增高,终末期肾病（ESRD）严重干扰着大众的生活质量和生命安全。终末期肾病的治疗一般有两种:血液净化或肾移植,血液净化只能够部分代替肾脏功能,且伴随着众多并发症,透析病人的生活质量及长期存活率较低,而高额的透析治疗费用也为个人、社会带来了巨大的经济负担。肾脏移植是目前治疗终末期肾病的最佳方法,但肾源短缺和移植后免疫排斥问题等严重制约了其广泛应用。我国现有透析等待肾脏移植的患者120万,数量逐年增加,而每年仅有5000个左右病人能有机会接受肾脏移植术,大量的病人在等待中经受痛苦或死亡。因此,通过新技术帮助肾脏再生,早日寻找到新的代替疗法成为了患者新的希望。近年来成体细胞重编程及转分化领域的研究发展迅速,终末分化的成体细胞在特殊条件诱导下能够分化为不同的组织细胞。该方法避免了人胚胎干细胞的伦理问题及多能诱导干细胞i PSC分化过程中的成瘤性,且得到的功能细胞具有本源细胞的表观遗传印记,拥有良好的应用前景。本研究希望通过过表达肾脏特异性的转录因子组合,将小鼠及人的成纤维细胞转分化为肾上皮样细胞（分别命名为mi REC和hi REC）,并利用表观遗传小分子化合物库模拟肾脏发育微环境诱导其进一步成熟,寻找可能替代相关转录因子的小分子,为肾脏发育和疾病提供新的模型,并为药物筛选、再生医学和个体化治疗提供一定的科学依据。研究方法1、将ACTB-td Tomato,-EGFP小鼠和Cdh16-cre小鼠交配获得Ksp-Cre;m TOM/m GFP基因型小鼠的胚胎分离提取成纤维细胞MEFs（Mouse embryo fibroblasts）,通过逆转录病毒载体将肾脏特异性转录因子Emx2,Pax8,Hnf4α和Hnf1β转染进MEFs细胞,经q RT-PCR和WB进行过表达验证,观察细胞出现绿色荧光GFP的时间和比例,通过流式分选仪分选出GFP阳性细胞（mi RECs）。2、将分选出的mi RECs进行培养、扩增和表型鉴定:细胞形态观测对比,结晶紫染色评估细胞克隆形成能力,上皮及肾脏特异性标志基因免疫荧光染色,q PCR检测肾脏相关基因m RNA水平,细胞3D培养成管能力检测和形态结构免疫荧光染色。3、将分选出的mi REC进行肾小管上皮细胞功能验证:白蛋白重吸收实验,顺铂、庆大霉素、他克莫司肾毒性药物检测。4、利用表观遗传化合物库进行小分子化合物高通量筛选,通过全自动活细胞监控仪CBM进行高通量检测,寻找相关促进肾小管上皮转分化的表观遗传分子通路。5、在人基因组中克隆出人CDH16启动子序列,构建人CDH16-promoter-GFP荧光报告基因载体,包装慢病毒后转染进人肾癌细胞系786-O和人胚肾细胞293t进行CDH16启动子功能验证。6、获取人原代包皮成纤维细胞,构建带CDH16-promoter-GFP荧光报告基因的成纤维细胞,通过慢病毒载体同样将肾脏特异性转录因子Emx2,Pax8,Hnf4α和Hnf1β转染进人原代包皮成纤维细胞,经q PCR和WB验证表达后观察GFP荧光,并根据GFP荧光信号、EPCAM抗体和THY-1抗体进行流式分选仪分选。7、将分选出的hi RECs进行培养、扩增和表型鉴定:细胞形态观测对比,上皮及肾脏特异性标志基因免疫荧光染色,q PCR检测肾脏相关基因m RNA水平,细胞3D培养成管能力检测和形态结构免疫荧光染色。研究结果1、Ksp-Cre;m TOM/m GFP小鼠胚胎成纤维细胞包含的肾小管转分化荧光报告系统无荧光泄漏现象,该系统对于重编程后的细胞具有良好分辨能力和分选效果,适合作为小鼠肾脏转分化的研究工具。2、小鼠胚胎成纤维细胞可通过过表达转录因子Emx2、Pax8、Hnf4a、Hnf1β而转分化为小鼠肾上皮样细胞mi RECs,具有特征性的上皮“铺路石”样形态和相应的克隆形成能力。mi RECs中上皮细胞粘附分子的m RNA水平如Cdh1、Cdh6和肾脏特异性Cdh16均表达升高。免疫荧光染色证明紧密连接分子ZO-1、E钙黏素E-cadherin、和上皮细胞粘附分子EPCAM均表达于mi RECs的细胞膜上。3、q PCR检测肾脏相关基因的转录组水平显示,除了维生素D受体VDR外,mi RECs显著表达与肾脏相关的标志基因,如谱系因子HNF1A、PAX2、CDH16以及离子通道转运蛋白相关基因GGT1、LPR2和slc家族等。同时mi RECs的间质相关基因均有明显程度的下降。4、mi RECs体外基质胶3D培养能够形成管腔样结构,免疫荧光染色后该肾小管样结构具有明显极性标志（ZO-1）和基底外侧标志（β-catenin）,而间质基因Vimentin则在肾小管中未见表达。5、我们通过荧光基团耦合的白蛋白重吸收实验发现,mi RECs的培养皿中荧光强度明显高于MEFs,显示了mi RECs的内吞功能。在肾毒性药物试验中,对于全部三种肾毒性药物顺铂、庆大霉素和他克莫司,mi RECs的死亡率明显大于MEFs细胞,说明了mi RECs细胞对肾毒性药物的敏感性。6、通过表观遗传化合物库（陶素）进行高通量筛选,我们发现具有抗氧化作用的小分子Resveratrol和6-Gingerol能够提高转分化效率3-5倍。7、通过流式检测和荧光显微镜观察,人CDH16promoter-GFP荧光报告基因能够在人胚肾293T和肾癌786-O细胞系中正常启动,能够帮助进行人类肾上皮转分化的首轮筛选。8、转录因子EMX2、PAX8、HNF1β和HNF4α诱导的人原代成纤维细胞中含有转分化成功的hi RECs,需要通过CDH16阳性、EPCAM阳性、THY-1阴性三项标准的分选方案获得。9、人原代成纤维细胞在转入肾特异性转录因子后,随着诱导过程的进展,q PCR结果显示肾脏相关基因的表达不断升高,在2周达到高峰,而间质基因的水平则逐步下降。对转分化之后的hi RECs进行相关标志基因的检测,hi RECs的肾脏相关基因表达水平与人肾组织相近,而间质基因则显著下调甚至沉默。10、免疫荧光染色证明紧密连接分子ZO-1、E钙黏素E-cadherin、和上皮细胞粘附分子Ep CAM均表达于hi REC的细胞膜上,而原代成纤维细胞的这些上皮基因则为阴性。同mi REC一样,hi REC也形成了具有上皮表面分子基因标志的管腔样结构。研究结论高等哺乳动物的体细胞大部分仍带有完整的遗传信息,因此依然具备可塑性。通过过表达肾脏谱系转录因子EMX2、PAX8、HNF4α、HNF1β,我们将小鼠胚胎成纤维细胞和人原代成纤维细胞转分化为肾上皮样细胞（mi RECs和hi RECs）。mi RECs细胞和hi RECs细胞均具有肾上皮样细胞形态和肾实质细胞类似的基因表达谱,能够在3D培养条件下形成管腔样结构,并且在体外具有部分肾小管重吸收功能和肾毒性药物的敏感性。此外,我们通过表观遗传小分子化合物的高通量筛选,发现了一类能够促进肾小管转分化的化合物Resveratrol和6-Gingerol。转分化得到的肾上皮样细胞可为肾脏发育和肾脏疾病研究提供新的模型,并能够应用于个体化治疗、药物筛选和再生医学。