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【研究背景】目前,中枢神经系统疾病的发病率呈逐年上升的趋势,给患者自身和社会都带来了十分沉重的负担,研究其预防和治疗策略具有重要的意义。神经系统损伤的机制多样,包含神经炎症、神经兴奋性毒性、病毒感染等。而我们课题组长期以来一直从事神经兴奋性毒性的研究。神经兴奋性毒性被认为是多种神经系统疾病发生发展的主要病理机制,指的是脑内过度释放以谷氨酸为代表的一系列兴奋性神经递质,激活相应的受体,引起神经元死亡。大量研究表明,神经兴奋性毒性常与神经炎症伴随发生。小胶质细胞,是中枢神经系统中的固有免疫细胞,监视神经微环境,快速感知各种异常的刺激,并迅速做出反应。小胶质细胞存在静息态与激活态两大表型。在病理环境下,小胶质细胞发生M1和M2型极化方式,分别释放促炎和抑炎因子,表现出损伤和保护的双重性。雌激素是体内一种重要的激素,具有广泛的神经保护作用,雌激素补充疗法可改善更年期女性的情绪和认知。雌激素膜受体GPR30是上世纪末被研究学者确认,这个世纪初才逐步被识别的一种受体,在脑内的分布与作用广泛。与经典雌激素核受体不同,GPR30介导快速的非基因组效应,可避免核受体过度活化导致乳腺癌和子宫内膜癌潜在风险的增加。我们课题组前期的体外研究结果表明:在谷氨酸引起的神经兴奋性毒性模型中,神经元和星形胶质细胞上的GPR30可通过调节自噬发挥保护作用。然而,作为CNS另一种重要的细胞类型,小胶质细胞上的GPR30在神经兴奋性毒性中扮演的角色目前还尚未阐明。【研究目的】在本研究中,使用N9小胶质细胞系,构建过量谷氨酸引起神经兴奋性毒性的体外模型。采用免疫荧光染色、MTT、荧光微球吞噬、划痕、条件性培养等方法,探讨小胶质细胞GPR30在神经兴奋性毒性中的作用及机制,为研究抗神经兴奋性毒性的治疗策略打牢理论基础。【研究方法】第一部分激活小胶质细胞GPR30减轻神经兴奋性毒性的作用研究1.通过免疫荧光染色,检测GPR30在N9小胶质细胞上的表达情况。2.外源性给予浓度为500μM的谷氨酸以制备神经兴奋性毒性的体外模型,并使用10 n M的G1（GPR30特异性激动剂）预处理30 min以激活小胶质细胞GPR30。在谷氨酸作用2 h、12 h、24 h这3个时间点,通过MTT法检测N9小胶质细胞的增殖情况。3.在谷氨酸处理24 h后,使用Western blot,通过检测小胶质细胞标志蛋白Iba-1的表达探究其活化水平。4.采用实时荧光定量PCR法,检测小胶质细胞M1与M2表型标志物的表达变化。5.采用粒径为1.0μm的羧基聚苯乙烯绿色荧光微球模拟细胞碎片,检测小胶质细胞的吞噬能力变化。6.采用划痕实验,检测激活GPR30对N9小胶质细胞迁移能力的影响。7.收集并制备小胶质细胞的条件培养基,用各处理组的条件培养基培养神经元24 h,检测神经元细胞活力。第二部分激活小胶质细胞GPR30减轻神经兴奋性毒性的机制研究1.分离N9小胶质细胞核蛋白和浆蛋白组分,使用Western blot法检测NF-κB P65蛋白表达水平。使用免疫荧光染色检测NF-κB P65在核浆中的分布变化。探究NF-κB途径是否参与小胶质细胞GPR30的作用。2.使用Western blot方法检测MAPK通路上的蛋白激酶（P38,ERK和JNK）的总蛋白以及磷酸化水平,检测MAPK通路是否参与小胶质细胞GPR30的作用。【研究结果】第一部分激活小胶质细胞GPR30减轻神经兴奋性毒性的作用研究1.免疫荧光染色结果提示,小胶质细胞标志蛋白Iba-1和GPR30共标,提示N9小胶质细胞表达GPR30。2.MTT结果提示,在谷氨酸处理2 h和12 h,N9小胶质细胞的增殖呈现增加趋势;在谷氨酸损伤24 h,细胞的增殖有了统计学差异。G1预处理30 min可显著逆转谷氨酸损伤24 h引起的细胞增殖。谷氨酸可上调N9小胶质细胞Iba-1水平,而G1预处理则显著降低其表达,提示激活N9小胶质细胞GPR30可降低神经兴奋性毒性引起的细胞增殖与活化。3.在神经兴奋性毒性模型中,小胶质细胞M1表型的标志物（CD86、TNF-α、IL-1β）表达明显升高,M2表型的标志物（CD206、Arg-1）水平显著降低,激活GPR30能够逆转上述变化,提示激活GPR30可减少N9小胶质细胞M1表型并增加M2表型。4.谷氨酸损伤24 h后,细胞所吞噬的荧光微球数目显著增加,G1预处理则显著逆转其增加,说明激活GPR30可减弱神经兴奋性毒性诱导N9小胶质细胞增强的吞噬能力。5.在神经兴奋性毒性的体外模型中,无论是否激活GPR30,小胶质细胞24 h内的迁移率没有明显差异,提示激活GPR30对其迁移能力无明显改变。6.谷氨酸损伤的条件培养基与神经元共培养后,神经元数目显著降低,但是G1预处理可改善这种损伤,说明N9小胶质细胞GPR30的激活可改善条件培养基对神经元的损伤。第二部分激活小胶质细胞GPR30减轻神经兴奋性毒性的机制研究1.谷氨酸处理后,浆蛋白中的NF-κB P65表达水平降低,但核蛋白中的表达升高,提示神经兴奋性毒性引起核转位现象,G1预处理可明显逆转P65核转位。免疫荧光染色同样发现G1处理组中P65入核比例减少,提示激活GPR30可逆转N9小胶质细胞NF-κB P65核转位。2.谷氨酸损伤引起N9小胶质细胞P38、ERK和JNK蛋白磷酸化水平的增加,G1降低了三者磷酸化的表达。P38、ERK和JNK的总蛋白水平无统计学差异。说明MAPK信号通路介导了N9小胶质细胞GPR30的保护效应。【研究结论】激活GPR30可抑制过量谷氨酸引起的小胶质细胞增殖活化、M1表型增加、M2表型减少、吞噬能力增强,从而保护神经元避免神经兴奋性毒性引起的损伤。NF-κB和MAPK信号通路可能参与小胶质细胞GPR30的保护作用,这为研究抗神经兴奋性毒性的治疗策略夯实了理论基础。