铁过量对鸡胚原代肝细胞及雏鸡肝脏氧化-抗氧化功能的影响

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铁是生命活动过程中不可或缺的微量元素,具有重要生理功能,机体主要通过二价铁离子(Fe2+)与血红蛋白结合运输氧气。过量铁会破坏铁稳态,对组织器官造成病理性损伤。铁主要储存在肝脏,肝脏在铁代谢过程中起至关重要的作用,多种铁代谢相关蛋白质在肝脏进行调节和表达。本研究分别以鸡胚原代肝细胞和SPF雏鸡为研究对象,从体外和体内两方面探讨铁过量对雏鸡肝脏氧化-抗氧化功能的影响。体外研究中,无菌条件下制备14胚龄鸡胚原代肝细胞,细胞培养液中外加Fe SO4;应用CCK-8法及钙黄绿素(Calcein AM)标记法确定最佳Fe2+浓度及作用时间,构建鸡胚原代肝细胞铁过量模型。应用化学比色法检测铁过量后鸡胚原代肝细胞一氧化氮(Nitric oxide,NO)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)含量;过氧化氢酶(Catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物还原酶(Glutathione peroxidas,GPx)、诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,i NOS)活力及总抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)水平;应用q PCR技术检测CAT、GPx4、i NOS、p53、SLC7A11(溶质载体家族7成员11)、Tf R1(转铁蛋白受体1)、Nrf2(核因子E2相关因子2)m RNA表达水平变化;应用间接ELISA法检测GPx4、i NOS蛋白含量变化;应用Western Blot方法检测CAT蛋白表达变化。体内试验中,将30只1日龄SPF雏鸡随机分为两组:对照组和铁过量组,其中铁过量组雏鸡于10日龄连续三天给以Fe SO4·7H2O 300 mg/m L生理盐水处理,于铁过量后7、14、21 d,每组随机取5只雏鸡,采取肝脏,观察肝脏大体病理变化并计算器官指数;采用石蜡组织切片、HE染色及普鲁士蓝染色观察肝脏病理组织学变化;采用化学比色法检测肝脏MDA、NO、GPx、CAT和T-AOC含量。试验主要结果如下:(1)成功建立鸡胚原代肝细胞铁过量模型。14胚龄鸡胚原代肝细胞培养72 h达到对数增长期,加入不同浓度Fe SO4后,细胞活力和LIP相对水平均降低。根据细胞活力及LIP相对水平情况,确定最佳Fe2+浓度为40μmol/L。(2)铁过量后,鸡胚原代肝细胞MDA、NO、H2O2含量与i NOS活力均不同程度升高,T-AOC水平与GPx、CAT和SOD活力均降低,i NOS、GPx4和CAT表达降低,表明铁过量后,肝细胞氧化物质增多,抗氧化物质含量减少,发生氧化应激,且氧化应激诱导铁死亡发生。(3)铁过量后,雏鸡肝脏MDA和NO含量升高,肝脏CAT、GPx活力和T-AOC下降,肝脏出现炎性细胞浸润、结缔组织增生以及含铁血黄素沉积等病理学变化。表明过量铁使肝脏出现病理损伤,氧化-抗氧化反应失衡。
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