肿瘤相关中性粒细胞通过上调IDO1导致尿路上皮癌免疫治疗抵抗的机制研究

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[目的]本研究拟在尿路上皮癌(Urothelial carcinoma,UC)中探讨肿瘤相关中性粒细胞(Tumor-associated neutrophil,TAN)通过促进肿瘤细胞中吲哚胺2,3-双加氧酶-1(Indoleamine 2,3-dioxygenase 1,IDO1)表达,进而导致肿瘤免疫治疗抵抗的机制,为肿瘤免疫治疗疗效预测提供生物标志物,并探究其作为免疫治疗靶点的临床潜力。[方法]1.探讨TAN浸润与UC PD-L1/PD1免疫治疗抵抗的相关性(1)引用Nassar等的文献中相关数据,根据患者是否对PD-L1/PD1抑制剂产生免疫治疗抵抗分为敏感组(Sensitive)和抵抗组(Resistant),评估NLR与UC患者PD-L1/PD1免疫治疗疗效的相关性。(2)分析本中心16例接受PD-L1/PD1免疫治疗的UC患者肿瘤组织中NLR与UC患者PD-L1/PD1免疫治疗疗效的相关性。(3)通过对上述患者组织标本进行CD66b免疫荧光染色及统计分析,进一步分析TAN与UC患者PD-L1/PD1免疫治疗疗效的相关性。2.寻找TAN引起PD-L1/PD1免疫治疗抵抗的免疫检查点(1)通过将15例UC患者组织进行高通量测序,根据CD66b高低分为两组,比较两组中免疫检查点(Immune checkpoint,IC)的表达差异,并将所得差异基因进行GSEA富集分析。(2)通过对上述UC患者组织切片进行CD66b和IDO1免疫荧光染色,利用Halo软件对CD66b和筛选所得免疫检查点IDO1进行荧光空间分析。(3)通过构建TAN与肿瘤细胞共培养模型,利用qRT-PCR技术获得TAN促进肿瘤细胞表达IDO1的体外证据。(4)通过对本中心16例接受免疫治疗的UC患者组织标本进行IDO1免疫荧光染色及统计分析,评估IDO1与UC患者免疫治疗疗效的相关性。3.研究TAN促进肿瘤细胞IDO1表达的分子机制3.1探究TAN是否通过细胞因子作用促进肿瘤细胞表达IDO1(1)对中性粒细胞上清中的细胞因子进行Bioplex筛选,利用细胞刺激实验和qRT-PCR技术检测筛选出的细胞因子对肿瘤细胞IDO1表达的影响。(2)利用高温使细胞因子蛋白变性,设置三组实验,利用三种不同上清培养T24细胞,分别为正常1640培养基、100℃煮沸30min的中性粒细胞上清和未煮中性粒细胞上清。流式细胞学技术检测T24细胞IDO1表达情况。3.2验证TAN可通过COX-2促进肿瘤细胞IDO1表达根据上述共培养模型加设一组COX-2抑制剂组(Celecoxib),利用qRT-PCR、流式细胞学技术检测肿瘤细胞IDO1表达情况。3.3验证TAN可通过COX-2激活肿瘤GSK3β通路从而促进IDO1表达(1)Western blotting检测T24细胞组、T24细胞与TAN共培养组以及加入Celecoxib抑制组的T24细胞的p-GSK3β以及IDO1的蛋白表达情况。(2)利用磷酸化蛋白芯片试剂盒,验证对照组T24细胞和共培养组T24细胞的p-GSK3β蛋白表达情况。4.体内动物模型探究Celecoxib、anti-PD1的联合阻断疗效通过构建C57BL/6小鼠MB49细胞皮下成瘤模型,成瘤后随机分成四组,分别为DMSO组、Celecoxib组、anti-PD1组及联合阻断组,比较四组小鼠肿瘤体积和重量变化情况;利用流式细胞学技术检测小鼠肿瘤组织中效应T细胞免疫表型的变化情况。[结果]1.TAN浸润与UC患者免疫治疗抵抗相关(1)对上述文献数据通过统计分析后发现,Sensitive组患者的外周血NLR低于Resistant 组,P<0.05。(2)我们通过分析本中心16例接受免疫治疗的UC患者的临床资料发现,Sensitive组患者的肿瘤组织中NLR低于Resistant组,P<0.05。(3)我们通过分析本中心16例接受免疫治疗的UC患者的临床资料发现,CD66b在Resistant组表达较高,P<0.05。2.TAN可通过促进肿瘤细胞IDO1表达进而引起免疫治疗抵抗(1)对本中心16例免疫治疗患者组织进行IC高通量测序后,根据CD66b表达高低分为两组,分析两组差异基因发现,TAN高浸润组中色氨酸代谢酶IDO1表达明显上调。随后将所得差异基因进行GSEA富集分析发现,TAN浸润与肿瘤色氨酸代谢密切相关。(2)使用Halo软件对CD66b和IDO1进行荧光空间分析发现,IDO1距离CD66b 9um时,其平均荧光强度达到高峰;之后,随着与CD66b之间距离的增加,IDOl的荧光强度呈现出降低的趋势。(3)共培养模型实验结果显示,qRT-PCR检测结果显示,共培养组T24、5637细胞系中IDO1的表达均有明显升高,P<0.01,P<0.001。(4)我们通过对组织标本进行免疫荧光染色分析发现,IDO1在Resistant组表达较高,差异具有统计学意义,P<0.05。3.TAN促进肿瘤细胞IDOl表达的分子机制3.1 TAN不通过细胞因子作用促进肿瘤细胞表达IDO1(1)Bioplex筛选中性粒细胞分泌的细胞因子发现,上清中CXCL1、MIF、IL-8等细胞因子高表达。qRT-PCR技术检测发现,不同时间不同浓度的上述细胞因子均不能上调肿瘤细胞IDO1表达,差异不具有统计学意义,P>0.05。(2)流式细胞学检测结果显示,上清煮沸组和上清未煮组肿瘤细胞IDO1表达无统计学差异,P>0.05。上述两组肿瘤细胞IDO1表达均高于阴性对照组,并具有统计学差异,P<0.05。3.2 TAN可通过COX-2促进肿瘤细胞IDO1表达qRT-PCR和流式结果显示,共培养组T24、5637细胞中IDO1的表达上调,Celecoxib 组 IDO1 的表达被抑制,P<0.05,P<0.01,P<0.001。3.3 TAN可通过COX-2激活肿瘤GSK3β通路从而促进IDO1表达(1)Western blotting结果显示:共培养组T24细胞的p-GSK3β和IDO1的蛋白表达上调,Celecoxib组T24细胞的p-GSK3β和IDO1的蛋白表达下调。(2)我们通过磷酸化蛋白芯片验证结果发现,共培养组T24细胞的p-GSK3β明显上调。4.体内动物模型探究Celecoxib、anti-PD1的联合阻断疗效Celecoxib、anti-PD1和联合阻断组小鼠肿瘤体积变化和肿瘤重量以及大小均小于对照组,其中联合阻断组最小。流式结果显示:Celecoxib组、anti-PD1组和联合阻断组CD8+Granzymeb+T细胞均高于对照组,CD4+Foxp3+T细胞少于其他组,其中,联合阻断组最明显,P<0.05,P<0.001。[结论]1.TAN通过分泌COX-2/PGE2激活肿瘤细胞GSK3β通路,从而促进IDO1表达,导致UC患者产生免疫治疗抵抗。2.Celecoxib、anti-PD1抗体的单一用药及联合阻断均能通过促进效应T细胞的杀伤表型、减少免疫抑制表型来延缓肿瘤进展,其中联合阻断组的疗效最为显著。
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