研究背景众所周知,卵巢癌是一种死亡率很高的女性生殖系统恶性肿瘤,发病十分隐匿并且目前缺乏有效的早期诊断指标与方法,导致多数卵巢癌患者首诊时已为肿瘤晚期,并且造成全身性广泛的肿瘤转移。目前临床中对卵巢癌的主要治疗方法为肿瘤切除术加上以铂类药物为主的化学治疗,但85%的卵巢癌患者在完成化疗后出现复发,导致晚期卵巢癌患者的生存率低于50%,导致这种现象最主要的原因是患者对药物产生耐受性与抵抗性。因此探究卵巢癌化疗耐药的发生机制对于寻找新的、有效的治疗手段尤为重要。外泌体是一类直径为30-150 nm的盘状囊泡,可由多种细胞通过胞吐形式分泌产生,外泌体内含有RNA,蛋白质,脂质等多种生物分子。外泌体可在细胞之间进行信息与物质的传递,参与调控细胞分化与组织发育。此外,外泌体参与细胞内化疗药物的外排,通过减少细胞内化疗药物含量降低药物对细胞的损伤,但是细胞通过外泌体外排药物的机制目前尚无相关研究。O-糖基化修饰（O-GlcNAc修饰）参与人体多种细胞多种蛋白的翻译后修饰过程,对于维持细胞稳定的生理功能具有关键作用,但是目前尚无研究表明O-糖基化修饰参与调控外泌体释放。研究发现参与调控外泌体释放的SNAP-23蛋白的同源蛋白SNAP-29能被O-糖基化修饰,并且促进SNAP-29与Stx17、VAMP8形成SNARE复合体,但SNAP-23能否被O-糖基化修饰,促进SNAP-23与Stx4、VAMP8形成SNARE复合体继而影响卵巢癌细胞外泌体释放水平目前尚不清楚。综合以上研究背景,我们做出假设:在卵巢癌对于铂类化疗药物耐药性形成的过程中,SNAP-23的O-糖基化修饰水平降低,同时促进SNAP-23与Stx4、VAMP8结合形成SNARE复合体,进而促进外泌体释放,从而使卵巢癌细胞通过外泌体外排的化疗药物增多,继而减少胞内药物的含量,进而提高卵巢癌细胞的化疗耐药性。研究目的1.探究卵巢癌细胞能否通过外泌体外排化疗药物产生耐药。2.阐明SNAP23的O-糖基化修饰介导的卵巢癌细胞外泌体释放的相关机制。研究方法1.下调OGT（O-GlcNAc Tranferase）表达水平对卵巢癌细胞外泌体释放的影响。通过对卵巢癌细胞转染shRNA慢病毒的方法下调细胞内OGT表达水平,同时进行嘌呤霉素筛选建立OGT低表达卵巢癌细胞株,并通过透射电镜（TEM）、纳米粒径示踪分析（NTA）、western blot的方法检测对照组与下调OGT组外泌体形态与分泌水平的差异。利用裸鼠皮下荷瘤的方法,分别将卵巢癌正常细胞株与OGT低表达细胞株注射到裸鼠皮下,待肿瘤生长至一定程度测定瘤体大小,通过western blot检测两组裸鼠血清中外泌体表面标志性蛋白CD63表达量有无明显差异。2.外泌体分泌水平对卵巢癌细胞顺铂耐药的影响。给予卵巢癌细胞不同浓度外泌体抑制剂GW4869,通过NTA检测外泌体分泌量。通过CCK8实验,流式细胞凋亡实验检测不同浓度GW4869处理条件对卵巢癌细胞的顺铂耐药性的影响。3.外泌体对下调OGT介导的卵巢癌细胞顺铂耐药的影响。体外实验检测下调OGT对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响,之后在下调OGT的同时给予外泌体抑制剂,观察卵巢癌细胞顺铂耐药性的变化情况。利用电感耦合等离子体质谱计（ICP-MS）检测外泌体与细胞内顺铂含量;通过共聚焦显微镜,透射电镜观察腔内小泡的数量。4.SNAP-23对下调OGT介导的外泌体释放的影响。通过si-RNA技术下调卵巢癌细胞SNAP-23表达水平,并利用western blot验证下调效果。通过NTA与western blot检测下调SNAP-23后外泌体分泌数量以及外泌体表面标志性蛋白的表达情况。CCK8与流式细胞术检测下调SNAP-23对卵巢癌细胞顺铂耐药耐药性的影响。5.卵巢癌细胞SNAP-23的O-糖基化修饰水平对SNARE复合体形成具有关键作用。通过western blot检测探究下调卵巢癌细胞OGT表达水平对SNAP-23表达的影响;通过CO-IP检测下调OGT表达水平对SNAP-23的O-糖基化修饰水平以及对于SNAP-23与Stx4和VAMP8的结合情况的影响。研究结果1.下调卵巢癌细胞OGT表达水平能够促进外泌体释放。通过对卵巢癌细胞（A2780和SKOV3）感染携带OGT shRNA的慢病毒的方法,并利用嘌呤霉素进行筛选,成功构建了OGT低表达卵巢癌细胞株。通过超速离心法提取卵巢癌细胞外泌体,并且通过TEM检测发现下调OGT表达水平对卵巢癌细胞外泌体形态无明显影响;NTA检测发现下调OGT后外泌体分泌数量增多;western blot检测发现下调OGT后外泌体表面标志性蛋白表达量增加。通过裸鼠皮下荷瘤实验进行验证,结果显示,下调OGT不影响肿瘤生长速度与瘤体大小,但能够促进卵巢癌细胞释放外泌体。2.外泌体参与调控卵巢癌细胞顺铂耐药。NTA检测发现给予不同浓度外泌体抑制剂GW4869时卵巢癌细胞外泌体分泌水平逐渐降低。CCK8检测发现,不同浓度GW4869的处理条件对卵巢癌细胞的增殖情况无明显影响,但给予顺铂处理后,随着GW4869浓度的增加,顺铂对卵巢癌的细胞的增殖抑制作用逐渐增强。流式细胞术检测发现不同浓度GW4869对卵巢癌细胞凋亡无明显影响,但给予顺铂处理后,随着GW4869浓度的增加细胞凋亡率逐渐增加。3.外泌体参与下调OGT介导的顺铂耐药。通过CCK8实验发现,卵巢癌细胞经顺铂处理后下调OGT的表达水平能够降低顺铂对卵巢癌细胞的增殖抑制作用,而加入外泌体抑制剂GW4869后,下调OGT对卵巢癌细胞的增殖抑制作用被逆转。通过流式细胞凋亡实验发现,顺铂处理后,下调OGT表达水平的卵巢癌细胞的凋亡率明显降低,而加入外泌体抑制剂GW4869能够逆转下调OGT表达水平介导的卵巢癌细胞对顺铂的凋亡率降低的作用。ICP-MS结果显示,随着外泌体抑制剂浓度的增加,外泌体中顺铂总量逐渐减少而细胞内顺铂含量逐渐增加;当给予卵巢癌细胞不同浓度顺铂处理时,随着处理浓度的增加,卵巢癌细胞分泌的外泌体中顺铂含量也随之增加;下调OGT使外泌体中顺铂总量增加,而对单个外泌体中顺铂含量无明显影响,加入GW4869后使外泌体中顺铂总量减少,而对单个外泌体中顺铂含量无明显影响。通过CD63荧光单标检测下调OGT后胞内外泌体数量,发现OGT低表达组胞内荧光数量明显减少。利用透射电镜检测卵巢癌细胞中腔内小泡数量,发现OGT低表达组细胞中腔内小泡数量明显减少。4.OGT通过下调SNAP-23的O-糖基化修饰水平介导卵巢癌细胞外泌体释放。通过对卵巢癌细胞转染si RNA的方法下调细胞SNAP-23的表达水平,NTA检测发现,卵巢癌细胞下调SNAP-23的表达水平后外泌体分泌量增多。通过western blot实验发现,下调SNAP-23后,CD63表达量增多。CCK8实验与流式细胞凋亡实验结果显示,卵巢癌细胞下调SNAP-23表达水平能够逆转O-糖基化修饰水平降低引起的卵巢癌细胞对于化疗药物顺铂的耐药性。5.卵巢癌细胞SNAP-23的O-糖基化修饰水平对SNARE复合体的形成具有重要作用。western blot实验结果显示,下调OGT表达水平能够降低O-糖基化修饰水平,但对于SNAP-23的表达量无明显影响。CO-IP实验结果显示,下调OGT的表达水平能够促进SNAP-23与Stx4和VAMP8结合形成SNAP-23-Stx4-VAMP8复合体的水平增加。研究结论1.O-糖基化修饰水平与卵巢癌细胞外泌体释放水平相关,O-糖基化修饰水平降低能够促进卵巢癌细胞外泌体释放。2.O-糖基化修饰水平降低通过促进卵巢癌细胞外泌体外排顺铂,从而增强细胞对于化疗药物顺铂的耐药性。3.下调OGT表达水平导致卵巢癌细胞SNAP-23蛋白的O-糖基化修饰水平降低,进而促进SNAP-23与Stx4和VAMP8结合形成SNAP-23-Stx4-VAMP8复合体,从而引起卵巢癌细胞外泌体释放增加。