【摘 要】
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运用分子对接技术确定药物治疗靶点是当今医药界研究的焦点之一。研究表明Toll样受体4（TLR4）信号通路是主要的炎症信号通路之一,它能介导炎性因子的释放而引起炎症。课题组前期研究发现艾纳香油能够抑制炎性因子的释放而发挥抗炎作用。那么艾纳香发挥抗炎作用的活性成分有哪些?艾纳香是否通过靶向TLR4信号通路的关键蛋白来发挥抗炎作用?这些都尚未可知。为此,本课题通过化学信息成分数据库以及文献调研建立艾纳香
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运用分子对接技术确定药物治疗靶点是当今医药界研究的焦点之一。研究表明Toll样受体4（TLR4）信号通路是主要的炎症信号通路之一,它能介导炎性因子的释放而引起炎症。课题组前期研究发现艾纳香油能够抑制炎性因子的释放而发挥抗炎作用。那么艾纳香发挥抗炎作用的活性成分有哪些?艾纳香是否通过靶向TLR4信号通路的关键蛋白来发挥抗炎作用?这些都尚未可知。为此,本课题通过化学信息成分数据库以及文献调研建立艾纳香小分子库,以TLR4信号通路关键蛋白TLR4、髓样分化蛋白-2（MD-2）、髓样分化因子88（My D88）、白细胞介素1受体关联激酶1（IRAK1）、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）、IκB激酶复合物β（IKKβ）为靶点,应用分子对接技术虚拟筛选艾纳香中抗炎活性成分,并利用TCMSP和Swiss ADME在线数据库预测其药理学活性,确定以麦角甾醇过氧化物或艾纳香素进行抗炎作用及机制研究;通过构建LPS致小鼠巨噬细胞RAW264.7炎性模型,运用MTT、酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫印迹（WB）、亚细胞结构定位等方法评估麦角甾醇过氧化物或艾纳香素的抗炎效果;最后,从TLR4/MD-2蛋白入手,应用流式细胞术、激光共聚焦、表面等离子共振技术、免疫共沉淀（Co-IP）、WB等方法研究麦角甾醇过氧化物或艾纳香素与TLR4/MD-2相互作用机制。1.分子对接筛选结果表明,艾纳香中与TLR4信号通路关键蛋白的综合打分排名前10的活性成分有:麦角甾醇过氧化物、胡萝卜甾醇、β-谷甾醇、16-贝壳杉烯、γ-杜松萜烯、芫花素、艾纳香素、木犀草素、Davidioside、金丝桃苷;进一步预测其药理学活性,发现麦角甾醇过氧化物或艾纳香素具有较好的药理学活性且在抗炎方面鲜有报道。2.MTT结果表明,在有无LPS存在的条件下,与空白组相比,麦角甾醇过氧化物组（0-160μg/ml）或艾纳香素组（0-80μg/ml）的细胞OD值无差异（P＞0.05）;ELISA法结果表明,与LPS组相比,麦角甾醇过氧化物组（10-40μg/ml）或艾纳香素组（5-20μg/ml）能显著减弱LPS介导的RAW264.7细胞因子白介素6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）的分泌（P＜0.01）;WB结果表明,与LPS组相比,麦角甾醇过氧化物组或艾纳香素组能够显著减弱核转录因子-κB（NF-κB）相关蛋白-核因子κB抑制蛋白α（IκB-α）的磷酸化水平（P＜0.01）和及NF-κB亚基p65的磷酸化水平（P＜0.01）并促进IκB-α的表达（P＜0.01）;亚细胞结构定位结果表明,与LPS组相比,麦角甾醇过氧化物组（20μg/ml）或艾纳香素组（10μg/ml）能减弱细胞核内与NF-κBp65偶联的绿色荧光量。3.分子对接结果表明,麦角甾醇过氧化物或艾纳香素与TLR4/MD-2的部分氨基酸残基存在范德华力、氢键以及疏水键等相互作用力;表面等离子共振结果显示麦角甾醇过氧化物或艾纳香素与TLR4/MD-2存在相互作用力;流式细胞术结果表明,与LPS组相比,麦角甾醇过氧化物组或艾纳香素组能抑制FITC-LPS与RAW264.7细胞的结合（P＜0.01）;激光共聚焦观察结果表明,与LPS组相比,麦角甾醇过氧化物组（20μg/ml）或艾纳香素组（10μg/ml）能减弱FITC-LPS的绿色荧光定位到RAW264.7细胞膜上;Co-IP结果表明,与LPS组相比,麦角甾醇过氧化物组（20μg/ml）或艾纳香素组（10μg/ml）能显著降低TLR4蛋白的沉淀量（P＜0.01）;WB结果表明,与LPS组相比,麦角甾醇过氧化物组或艾纳香素组能显著降低TLR4下游级联蛋白IRAK1的磷酸化水平（P＜0.01）。结果提示,我们进一步明确了艾纳香中可能的抗炎活性成分,麦角甾醇过氧化物和艾纳香素是艾纳香中发挥抗炎作用的主要活性成分,其可以通过靶向TLR4/MD-2来阻断LPS/TLR4胞外信号传导,从而抑制TLR4与MD-2的二聚化以及IRAK1的磷酸化,进而抑制NF-κBp65入核以及细胞因子分泌,最终阻止TLR4信号通路活化而发挥抗炎作用。本研究发现了麦角甾醇过氧化物和艾纳香素新的药理活性以及作用靶点,为深度挖掘艾纳香的药理作用提供了一定的参考依据。
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