背景:遗传谱系追踪是揭示细胞起源、命运和可塑性必不可少的重要手段。对于生理、病理条件下组织的重塑机制,谱系追踪也提供了一个在单细胞水平解析空间、时间和动力学变化的有力工具。Cre-loxP重组系统,包括他莫西芬诱导的CreER-loxP系统,是追踪体内干细胞和祖细胞分化最为广泛应用的技术手段。然而,大量研究表明CreER-loxP系统在一定程度上存在泄露现象,这意味着在没有他莫西芬诱导的条件下发生自发细胞标记。泄露现象导致发育领域的许多重要问题长期存在巨大争议,包括成年胰岛β细胞动态平衡机制以及心脏干细胞是否存在。目的:本研究的目的是构建一个可诱导且膜定位的CreER,减少CreER自发进入细胞核的几率,从而降低经典CreER-loxP系统的泄露率。方法:我们构建了膜定位的CreER（mCreER:CD8α-FRB-CS-CreER）和膜定位的 TEVp（mTEVp:CD8α-FKBP-TEVp,Tobacco Etch Virus protease）。在雷帕霉素诱导下,FKBP和FRB发生蛋白二聚化,TEVp切割CS位点,膜定位的CreER被释放;然后他莫昔芬诱导CreER进入细胞核。我们用激光共聚焦和流式细胞分析技术,检测CreER和mCreER在Ad293细胞及Ad293CR细胞（含Cre的报告基因）的重组率和泄露率;用共免疫沉淀、定量实时RT-PCR、RNA干扰和Western blot印记等方法,检测mCreER的亚细胞定位及与HSP90之间的相互关系;通过细胞活性测定、Western blot分析、荧光免疫染色、细胞周期分析和实时定量RT-PCR等方法检测mCreER的细胞毒性。最后,我们构建了胰岛素启动子（RIP）控制的CreER、mCreER或mTEVp慢病毒表达载体,检验RIP启动子的特异性和mCerER在MIN6胰岛β细胞的毒性。结果:经典CreER-loxP系统的实验结果表明,在24h和48h诱导条件下,Ad293细胞标记率为51.6-79.7%;而在非诱导条件下,细胞标记率达24.1-58.3%,即泄露率可到达47.2-74.1%。对于膜定位CreER-loxP系统,在无诱导条件下,只有极少Ad293CR细胞被标记;而在雷帕霉素、他莫昔芬或两种诱导物同时存在条件下,细胞标记率分别为4.8-8.5%,7.3-18.0%和15.6-33.9%（24h-48h）。结果表明,mCreER的泄露率有效减少,从70%降低至5%（48h）。利用EGFP融合蛋白追踪CreER的亚细胞定位,结果发现,在非诱导条件下,EGFP在细胞核中的比例达到45.1-79.5%;对于mCreER-EGFP,当没有雷帕霉素/他莫昔芬诱导时,几乎所有的EGFP定位在细胞膜,结果表明膜定位系统能够有效减少CreER的核转移。以上研究还显示,雷帕霉素和他莫昔芬在mCreER系统中具有协同效应,为研究其机制,我们用siRNA敲降HSP90。转染72h,HSP90的蛋白表达水平和转录水平分别降低至17.3%和10.1%。同时,HSP90表达量减少导致mCreER在非诱导条件下被TEVp切割的比例升高,最终导致mCreER系统的严谨性丧失。我们的研究结果还发现,转染CreER质粒的Ad293细胞,经过24h或48h的他莫昔芬诱导,细胞活力严重下降;而mCreER系统不影响细胞增殖,这意味着mCreER系统能够有效地降低细胞毒性。采用细胞流式技术分析细胞周期,结果表明,CreER导致G1细胞周期占比减少,G2/M期占比增多;相反,mCreER对细胞周期的影响较小。γ-H2AX蛋白印迹和免疫染色结果显示,CreER表达造成基因组DNA严重损伤。qRT-PCR和蛋白印迹结果显示,P53的转录和蛋白水平上升,该结果与γ-H2AX的相似。Ad293CR细胞转导Lenti-RIP-CreER慢病毒,病毒感染后24h或48h,非诱导的细胞标记达12.4和24.8%。相反,转导Lenti-RIP-mCreE/Lenti-RIP-mTEVp慢病毒的Ad293CR细胞,非诱导的细胞标记仅有7%。在MIN6胰岛β细胞,mCreER的低细胞毒性不仅保留了细胞活力,在高糖浓度条件下,mCreER系统不影响MIN6细胞胰岛素含量及分泌。结论:双诱导且膜定位的CreER系统能阻止非诱导条件下CreER进入细胞核。通过雷帕霉素/他莫昔芬的诱导,FRB和FKBP发生二聚化,膜定位的CreER被mTEVp切割,然后,在他莫昔芬的诱导下,CreER进入到细胞核。膜定位系统具有泄露率低和细胞毒性弱的优点,同时又不影响细胞标记效率。尽管尚未在体内研究进行测试,新型双诱导膜定位CreER系统以更精确的时间和空间调控方式为细胞谱系追踪和基因组工程研究提供新思路。