目的:军团菌是自然界中广泛存在的革兰氏阴性菌,在自然环境、人工环境水源及湿润的土壤中均可生长繁殖。军团菌属机会致病菌,糖尿病患者肺部合并军团菌感染的风险增加、疾病控制率低、病死率高。目前针对糖尿病合并军团菌的研究多为临床个案报道及临床回顾性研究,而缺乏针对糖尿病合并军团菌具体机制的研究。缺氧诱导因子1α（HIF-1α）是组织为适应氧状态下激活的转录因子,既往研究表明,HIF-1α对病原体感染等造成的炎症反应具有调节作用。本研究将通过建立糖尿病合并军团菌肺炎模型,研究其病理变化及HIF-1α在其中起到的调控作用。研究方法:本研究分三部分,第一部分研究糖尿病豚鼠合并肺部感染1型嗜肺军团菌后HIF-1a及相关通路蛋白的表达变化。实验动物分为四组:正常对照组,糖尿病对照组、军团菌感染组、糖尿病合并军团菌感染组。糖尿病豚鼠通过联合应用育亨宾与链脲佐菌素破坏胰岛细胞建立。糖尿病模型建立成功后对豚鼠进行气管插管接种嗜肺军团菌（Lp）菌悬液建立军团菌肺炎模型,在感染后24小时、48小时、72小时组三个时间进行取材。通过吉姆萨染色、军团菌原位免疫荧光检测明确肺组织内Lp增殖情况,通过HE染色明确肺组织炎症浸润情况。之后进行肺组织匀浆Western blot及免疫组化明确HIF-1α、i NOS、NF-κb、SIRT6蛋白表达变化。第二部分应用FG4592增加糖尿病豚鼠感染军团菌后HIF-1a的表达,观察其对肺部军团菌感染的影响。实验动物分糖尿病对照组、糖尿病合并军团菌感染组、FG4592处理糖尿病组、FG4592处理糖尿病合并军团菌感染组。糖尿病豚鼠建立方法同第一部分,FG4592处理糖尿病组在感染前1周以10mg/kg剂量隔日腹腔注射,覆盖感染全程。通过吉姆萨染色、军团菌原位免疫荧光检测,明确肺组织内Lp增殖情况,通过HE染色明确肺组织炎症浸润情况。之后进行肺组织匀浆Western blot及免疫组化明确HIF-1α、i NOS、NF-κb、SIRT6蛋白表达变化。明确增加HIF-1α的表达对肺组织内Lp增殖情况、肺组织炎性浸润及对相关蛋白的调控作用。第三部分为缺氧诱导因子在高糖条件下对军团菌感染诱导分化人巨噬细胞的影响及机制研究。使用PMA诱导THP-1分化为巨噬细胞,分为正常培养组、高糖培养组及FG4592处理高糖培养组,高糖培养组及FG4592处理高糖培养组分别在军团菌感染前使用含30m M葡萄糖的高糖培养基和含有5n M FG4592的高糖培养基刺激24小时。刺激后使用MOI=1的含有Lp的培养基使Lp与巨噬细胞共培养2小时,去除细胞外细菌,在感染后24小时、48小时、72小时三个时间点对细胞内Lp增殖情况、HIF-1α蛋白表达、ROS、线粒体膜电位及细胞上清乳酸水平,明确增加HIF-1α的表达对高糖环境下Lp感染巨噬细胞的调控作用。结果:1.第一部分:糖尿病豚鼠合并肺部感染嗜肺军团菌后HIF-1a及相关通路蛋白的表达变化。HE染色提示糖尿病加重了肺部Lp感染后的病程进展及炎症浸润。吉姆萨染色肺组织Lp原位荧光杂交检测提示相对于非糖尿病组,感染军团菌48h后,糖尿病豚鼠肺内军团菌增殖程度明显升高。Werstern blot及免疫组化均表明,未感染豚鼠肺组织糖尿病及非糖尿病组均未有明确HIF-1a蛋白表达,感染后HIF-1α在感染后炎症浸润区域表达明显,随炎症浸润加重表达量明显增高,糖尿病组感染后HIF-1α表达较非糖尿病组显著降低。感染后24小时非糖尿病组i NOS表达较糖尿病组明显升高,48小时开始降低,糖尿病组i NOS表达水平于48小时达到高峰,72小时迅速下降。NF-κb蛋白表达水平,在非感染条件下糖尿病组NF-κb水平即有明显升高,感染后蛋白表达水平均上升,72小时两组蛋白水平下降,糖尿病组水平较非糖尿病组蛋白水平明显增高。SIRT6蛋白水平在糖尿病未感染豚鼠肺组织中略有升高,但无统计学意义。在军团菌感染后表达明显升高,72小时时间点糖尿病组蛋白表达水平较非糖尿病组明显下降。2.第二部分:应用FG4592增加糖尿病豚鼠感染后HIF-1a表达对肺部军团菌感染的影响。Western blot及免疫组化结果提示应用FG4592后提高了糖尿病豚鼠感染后HIF-1α的表达,HE染色表明HIF-1α增加后糖尿病合并感染组炎症情况明显减轻。吉姆萨及原位荧光杂交检测提示FG4592处理糖尿病组肺组织内Lp增殖情况较糖尿病组明显受到抑制。对i NOS、NF-κb及SIRT6蛋白的Western blot及免疫组化结果提示,相比糖尿病组,FG4592处理组i NOS表达明显降低,但感染24小时后,FG4592处理糖尿病组i NOS水平较糖尿病组迅速升高,而48小时蛋白表达水平骤降,糖尿病组蛋白表达水平仍可维持,72小时两组i NOS蛋白表达均较低,无明显差异。NF-κb在糖尿病豚鼠肺组织内的表达水平较FG4592处理组升高明显,感染后24小时FG4592组蛋白表达比糖尿病组增加,48小时二组间无明显差异,而72小时二组蛋白表达水平均有明显下降,但糖尿病组水平较FG4592处理糖尿病组高,FG4592处理糖尿病组较糖尿病组在未感染时SIRT6水平稍有降低,但在免疫组化统计学上无明显差异,感染后FG4592处理糖尿病组SIRT6蛋白表达增加明显,但24小时低于糖尿病组,72小时二组蛋白水平均明显下降,FG4592处理糖尿病组高于糖尿病组。3.第三部分:缺氧诱导因子在高糖条件下对军团菌感染诱导分化人巨噬细胞的影响及机制研究。对共培养后的细胞裂解进行细胞技术,24小时各组细胞内Lp增殖水平无明显差异,高糖培养组细胞内Lp在48小时、72小时增殖情况明显高于正常培养组及FG4592处理的高糖培养组。细胞感染Lp后24小时,正常培养组HIF-1α蛋白表达高于高糖培养组,48、72小时未观察到明显差异,使用FG4592药物处理后的高糖培养细胞,在未感染时HIF-1α表达即高于高糖培养组,感染后24、48小时HIF-1α蛋白表达未见明显差异,在72小时FG4592处理组较高糖培养组明显升高。ROS检测结果提示,感染后24小时ROS表达三组间无明显差异,48小时ROS表达水平均升高明显,高糖处理组ROS表达水平明显高于正常培养基培养组及FG4592处理后的高糖培养组,72小时高糖处理组的ROS表达同样高于正常培养组及FG4592处理组。细胞线粒体膜电位检测提示,在未感染Lp时,高糖培养基处理组线粒体膜电位水平较正常培养组下降,应用FG4592处理后高糖培养基处理组的线粒体膜电位水平恢复。感染后24小时三组膜电位无明显下降,三组膜电位趋势与未感染时相仿。感染48小时后膜电位水平下降明显,高糖处理组表达水平明显低于正常培养组,使用FG4592处理后线粒体膜电位水平恢复。72小时组三组膜电位水平进一步下降。结论:1.糖尿病增加了军团菌感染后肺部的损害,炎症浸润加重,细菌复制增加,抑制了肺部感染军团菌后HIF-1α的表达,增加了非感染状态下i NOS、NF-κb、SIRT6的表达,并且在感染晚期影响i NOS、NF-κb的降解以及SIRT6水平的维持。2.应用FG4592增加糖尿病豚鼠军团菌感染后HIF-1α表达可减轻军团菌在肺组织内的复制及炎症浸润。增加HIF-1α在感染早期通过促进i NOS、NF-κb的表达,并减少了SIRT6对HIF-1α的抑制作用,以抑制军团菌在肺组织内增殖,在感染晚期通过抑制i NOS、NF-κb的表达、增加SIRT6的表达,减轻了过度的炎症反应。3.高糖条件抑制巨噬细胞感染军团菌后HIF-1α表达,增加军团菌在细胞内增殖,增加HIF-1α水平可抑制军团菌在细胞内的复制。增加HIF-1α表达可减轻高糖条件增加的细胞ROS水平,减轻感染后细胞的炎症损伤,并可减轻高糖对线粒体膜电位的损伤,改善细胞感染后呼吸功能,减少感染后高糖条件下细胞的糖酵解水平,抑制高糖对细胞内军团菌复制的促进作用。