目的:乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染除可以导致肝脏发生慢性进展性疾病之外,还可累及骨髓导致血小板生成障碍,但HBV主要作用于血小板生成的哪一阶段及相关机制不清。本研究以造血干细胞定向分化至巨核细胞为研究对象,加入不同病毒载量的HBV,探讨HBV对巨核细胞不同发育时期的影响及分子机制,为未来临床靶向治疗提供科学依据。研究内容与方法:第一部分:HBV对不同发育阶段巨核细胞的影响1)体外诱导造血干细胞定向分化至巨核细胞:取新鲜足月健康产妇脐带血、加入磁珠分选出CD34+造血干细胞,体外加入巨核细胞扩增因子（包括:IL-6、SCF、IL-9、TPO）,定向分化至巨核细胞的不同发育阶段。不同时间点确定巨核细胞的不同阶段,各阶段细胞的表面抗原标志:多能造血干细胞是CD34bright,未成熟巨核细胞是CD34modCD41modCD42dim,成熟巨核细胞是CD34dimCD41brightCD42bright,活化的血小板是CD62pbright。2)建立HBV感染巨核细胞发育过程模型:提取Hep AD38细胞的上清液制备不同病毒载量的HBV病毒原液与上步提取的造血干细胞共培养。在巨核细胞的不同发育阶段,应用COBAS Taqman HBV DNA分析仪检测细胞上清液中HBVDNA的载量、应用PCR方法检测不同发育阶段的巨核细胞中HBVccc DNA的表达、应用免疫荧光技术检测巨核细胞中HBs Ag的分布,证实HBV感染巨核细胞发育过程模型建立成功。3)不同病毒载量的HBV对未成熟巨核细胞、成熟巨核细胞及血小板活化的影响:（1）未成熟巨核细胞阶段,应用CCK-8方法检测未成熟巨核细胞的增殖情况、细胞周期PI检测细胞的增殖及复制情况;Annexin V/PI双染法检测细胞的凋亡情况。（2）成熟巨核细胞阶段,应用流式细胞术检测细胞表面CD34、CD41、CD42的表达,评估巨核细胞的分化成熟情况;（3）在血小板生成阶段,阶梯式离心方法提取富血小板悬液,在凝血酶刺激后应用流式细胞术检测血小板活化标记物CD62p的表达,评估HBV对血小板功能的影响。第二部分:HBV促进未成熟巨核细胞凋亡的分子机制研究1)病毒来源:提取Hep AD38细胞的上清液,经过过滤、沉淀,制备成HBV病毒原液(Hep AD38是Hep G2衍生的稳定细胞系,支持四环素诱导的HBV复制[1]);2)未成熟巨核细胞来源:应用人成巨核细胞白血病细胞系Meg-01,体外加入促血小板生成素（thrombopoietin,TPO）[2],培养至未成熟巨核细胞阶段;3)将上述1)提取的病毒与2)来源的细胞进行共培养,在未成熟巨核细胞阶段,应用透射电镜观察细胞超微结构、应用免疫荧光技术检测细胞中HBs Ag的红色荧光分布,并且在不同时间点、应用COBAS Taqman HBV DNA分析仪检测细胞上清液中HBVDNA的载量,证实HBV感染未成熟巨核细胞成功;4)检测巨核细胞凋亡相关因子Bcl2l2及Bax的表达,分析HBV促进未成熟巨核细胞凋亡的分子机制。第三部分:HBV抑制成熟巨核细胞分化的分子机制研究1)HBV对成熟巨核细胞的多倍体化、细胞骨架形成及不同分化时期的影响:（1）在成熟巨核细胞阶段,流式细胞术检测DNA倍体数目,评估HBV对成熟巨核细胞多倍体形成的影响;（2）同阶段应用免疫荧光技术检测细胞中骨架蛋白鬼比环肽的分布,评估HBV对细胞骨架形成的影响;（3）在成熟巨核细胞的分化早期及晚期,应用流式细胞术检测细胞表面CD34、CD41、CD42的表达,评估巨核细胞的分化成熟情况。分析HBV对成熟巨核细胞不同分化时期的抑制作用;2)筛选HBV抑制成熟巨核细胞分化的关键蛋白:成熟巨核细胞阶段,通过Labelfree定量蛋白质组学联合生物信息学分析,筛选HBV抑制细胞分化的关键蛋白,并应用Western blot及RT-PCR进行蛋白及转录水平的验证;3)HBV上调UBE4B后成熟巨核细胞中相关蛋白的表达情况:结合UBE4B的蛋白特性与巨核细胞发育分化过程的调控因子的相关性,检测成熟巨核细胞中p53、p-p53、ERK1/2、p-ERK1/2的相对定量表达;4)HBV通过上调UBE4B抑制成熟巨核细胞分化的分子机制:慢病毒转染Meg-01细胞、敲减UBE4B基因后,流式细胞术检测成熟巨核细胞不同时期细胞表面抗原的表达情况,评估HBV对于成熟巨核细胞分化的抑制作用是否解除。并应用Western blot检测p53、p-p53、ERK1/2、p-ERK1/2的相对定量表达,以明确UBE4B作用的分子机制。结果:第一部分:1)HBV促进未成熟巨核细胞凋亡:实验分为对照组、HBV低病毒载量感染组(HBVlow组)、HBV高病毒载量感染组(HBVhigh组)三组。CCK-8实验检测细胞增殖情况,结果提示不同组别的细胞之间细胞增殖率无差异。流式细胞术检测细胞周期,结果提示三组细胞间G0/G1%、S%、G2/M%各时期的比例无差异。同阶段,应用Annexin V/PI双染检测细胞凋亡情况,结果提示HBVhigh组细胞凋亡率（Q2区+Q3区）高于对照组,HBVlow组与对照组之间无明显差异;2)HBV抑制成熟巨核细胞分化:流式细胞术检测结果提示CD34在各组间的表达对照组＜HBVlow组＜HBVhigh组(对照组与HBVhigh组相比P=0.0090),CD41在三组间无明显差异,CD42在各组间的表达对照组＞HBVlow组＞HBVhigh组(对照组与HBVhigh组相比P＜0.0001);3)HBV抑制血小板的活化功能:流式细胞术检测三组细胞富血小板悬液中血小板活化标记CD62p的表达情况,结果提示对照组＞HBVlow组＞HBVhigh组(对照组与HBVhigh组相比P=0.0463)。第二部分:未成熟巨核细胞阶段,RT-PCR检测与巨核细胞凋亡相关的抑凋亡因子Bcl2l2以及促凋亡因子Bax的表达情况,结果提示对照组Bcl2l2的相对表达高于HBV感染组（P=0.0002）,Bax的表达差异无统计学意义。两组相比Bcl2l2/Bax的比值,对照组高于HBV感染组（P=0.0054）。第三部分:1)成熟巨核细胞阶段,（1）流式细胞术检测细胞的DNA多倍体化情况,结果对照组DNA倍体数目≤2N的细胞比例低于HBV感染组（P=0.0238）、≥4N/≤2N的比值高于HBV感染组（P=0.0484）;（2）同阶段,应用免疫荧光试验检测细胞骨架蛋白鬼比环肽的表达情况,对照组鬼比环肽的分布及平均荧光强度均高于HBV感染组（P=0.0022）;（3）成熟巨核细胞分化早期,流式细胞术检测两组细胞CD34及CD42的平均荧光表达强度,结果提示CD34的表达对照组低于HBV感染组（P=0.015）,CD42的表达对照组高于HBV感染组、差异无统计学意义。至成熟巨核细胞分化晚期,同样检测上述表面抗原,结果提示CD34与CD42的差异更明显（P=0.0003,P＜0.00001）,均存在显著统计学意义;2)在送检的HBV感染的成熟巨核细胞及对照组的6组样本中,共鉴定到蛋白质3643个。结合蛋白的差异倍数及生物信息学分析结果,并在细胞中进行表达验证,UBE4B蛋白在HBV感染前后的成熟巨核细胞中差异存在统计学意义;3)成熟巨核细胞阶段,比较HBV感染组及对照组与UBE4B相关蛋白的表达情况,结果提示p53及p-p53的表达,对照组高于HBV感染组（P=0.031,P=0.0003）。ERK1/2及p-ERK1/2的表达,对照组低于HBV感染组（ERK1/2的差异无统计学意义,p-ERK1/2的差异P=0.0015）。p-p53/p53的比值两组相比,对照组p53的磷酸化水平高于HBV感染组（P＜0.00001）。p-ERK1/2/ERK1/2的比值两组相比,对照组ERK1/2的磷酸化水平低于HBV感染组（P=0.0009）;4)敲减巨核细胞中UBE4B基因后,此部分实验分为对照组（NC组）、空病毒载体组（EV组）、UBE4B基因敲减组（sh RNA-UBE4B组）三组。成熟巨核细胞分化早期,三组细胞CD34、CD41及CD42的平均荧光表达强度无明显差异;成熟巨核细胞分化晚期,CD34、CD41及CD42在NC组及EV组之间表达无差异。在sh RNA-UBE4B组中,CD34的表达低于NC组（P＜0.00001）,CD41及CD42的表达高于NC组（P＜0.00001）。在成熟巨核细胞分化早期,比较三组细胞之间相关蛋白的表达情况。结果提示:NC组比sh RNA-UBE4B组,p-p53以及p53（P=0.0032和P=0.0041）、p-ERK1/2及ERK1/2的表达均低（P=0.0569,P=0.0020）。p-p53/p53在三组之间差异无统计学意义。但p-ERK1/2比ERK1/2比值,NC组及EV组均高于sh RNA-UBE4B组（与NC组差异P=0.0216）,且EV组与NC组之间无统计学差异;在成熟巨核细胞分化晚期,三组间蛋白表达情况:NC组比sh RNA-UBE4B组,p-p53以及p53的表达均低（P=0.0002和P＜0.0001）、p-p53/p53的比值亦低（P=0.0168）。p-ERK1/2及ERK1/2的表达均高（P=0.0028和P=0.0020）,p-ERK1/2比ERK1/2的比值亦高（P=0.0017）,差异更显著,且EV组与NC组之间无统计学差异。结论:1)HBV能够促进未成熟巨核细胞凋亡、抑制成熟巨核细胞分化,导致血小板生成障碍;2)HBV能够抑制血小板活化,导致血小板功能异常;3)HBV通过下调Bcl2l2/Bax促进未成熟巨核细胞凋亡;4)HBV通过抑制成熟巨核细胞多倍体化及骨架形成,且对分化晚期阶段的抑制作用更强,导致血小板生成障碍;5)HBV通过上调成熟巨核细胞中UBE4B蛋白的表达,抑制细胞中p53的表达及磷酸化,从而抑制细胞分化;6)HBV通过上调成熟巨核细胞中UBE4B蛋白的表达,提高细胞中ERK1/2的表达及磷酸化,从而抑制细胞分化;综上,HBV能够通过下调Bcl2l2/Bax促进未成熟巨核细胞凋亡,通过上调UBE4B蛋白的表达、抑制p53的表达及磷酸化并提高ERK1/2的表达及磷酸化,抑制成熟巨核细胞分化,从而导致血小板的生成障碍。