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背景:Neu-Laxova综合征是一种常染色体隐性遗传病,是以多种先天性畸形为特征的致死性疾病,其特征在于严重的子宫内生长受限,头部和颅面部的独特异常,肢体异常,皮肤异常,低出生体重等。Neu-Laxova综合征是由编码丝氨酸生物合成过程中关键酶的PHGDH、PSAT1和PSPH基因纯合或复合杂合突变引起的,这些基因编码的酶在细胞增殖中起重要作用并且参与丝氨酸生物合成途径。PHGDH基因位于人类1号染色体短臂的1区2带,由它编码的PHGDH是L-丝氨酸从头合成的关键酶,在细胞及物质代谢中及机体生长发育中扮演着重要角色及发挥重要作用。在丝氨酸生物合成的过程中,PHGDH将3-磷酸甘油酸氧化糖酵解为磷酸羟基丙酮酸,这是丝氨酸合成的第一步,而后在一系列酶（PSAT1及PSPH）的催化作用下转氨基、脱磷酸最终合成丝氨酸。而丝氨酸在核苷酸、磷脂丝氨酸、鞘氨醇等生物因子的合成中发挥重要作用,这些生物因子均是蛋白和细胞增殖所必须的。L-丝氨酸是一种神经营养因子,其缺乏可能会影响神经细胞生存、生长、分化,影响神经元的树突伸长和突触发生,因此PHGDH基因突变可能导致丝氨酸生物合成和转运过程中缺陷,使L-丝氨酸缺乏从而对大脑发育产生有害影响。另外,丝氨酸缺乏导致活性四氢叶酸合成不足,可能影响表皮细胞的分裂和转换,进而导致Neu-Laxova综合征皮肤表型的发生。截至目前文献已报道的与该病相关的PHGDH基因突变有15个:c.418G＞A（p.Gly140Arg）,c.488G＞A（p.Arg163Gln）,c.160C＞T（p.Arg54Cys）,c.793G＞A（p.Glu265Lys）,c.856G＞C（p.Ala286Pro）,c.1297C＞T（p.Gln433*）,c.1518G＞A（p.Trp506*）,c.1286G＞T（p.Gly429Val）,c.399G＞A（p.Trp133*）,c.1A＞C（p.Met1?）,c.1468G＞A（p.Val490Met）,c.1263C＞G（p.Cys421Trp）,c.746T＞C（p.Leu249Pro）,c.638C＞T（p.Thr213Met）,c.704C＞T（p.Ala235Val）。目的:在本研究中,我们发现一因多发畸形引产的病例,胎儿表现为严重宫内生长受限、多发畸形（小下颌畸形,面容异常,心脏整体偏小等）,通过表型分析及查阅参考文献,考虑该胎儿可能为Neu-Laxova综合征。充分对家属进行告知后,征得同意并签署知情同意书,我们对引产胎儿及父母行一家三口全外显子组测序（Trios Whole Exons Sequencing,Trios-WES）以期明确遗传学致病原因。Trios-WES结果提示引产胎儿携带PHGDH基因三个变异位点:c.488G＞A,c.607A＞T及c.743C＞T,其中父亲携带c.488G＞A变异位点,该位点在Clinvar数据库中记录为致病变异,母亲携带c.607A＞T及c.743C＞T变异位点,理论上两个位点存在于同一条染色体上,均未见数据库记载及文献报道,根据ACMG评级,两个位点致病性均为临床意义未明（VUS）。为了确认c.607A＞T及c.743C＞T变异位点的致病性,以及目前对PHGDH基因突变导致Neu-Laxova综合征的机制研究较少,本课题拟制备PHGDH野生型及突变型（c.488G＞A,c.607A＞T及c.743C＞T）过表达慢病毒,构建HEK293T稳转细胞株,通过细胞实验及酶活实验确认三个变异位点的致病性,阐明PHGDH基因复合杂合突变对PHGDH蛋白功能的影响以及初步解释胎儿异常表型的分子机制,使我们对Neu-Laxova综合征的发生理解得更加充分,为该家系的遗传咨询,产前诊断及胚胎植入前诊断提供理论依据。方法:1、标本及细胞系留取疑似Neu-Laxova综合征胎儿的肌肉组织及其父母的外周血,用于后续一家三口全外显子组测序（Trios Whole Exons Sequencing,Trios-WES）分析。父母双方都签署了知情同意书。本研究采用人胚胎肾细胞细胞系,即HEK293T,购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。2、实验方法（1）采用全外显子组测序筛选该疑似Neu-Laxova综合征胎儿及其父母的基因突变,应用Sanger测序再次验证筛选到的基因突变位点;（2）应用SWISS-MODEL workspace生物信息学软件,预测突变型与野生型PHGDH的蛋白结构差异;（3）应用Real-Time PCR、Western blot、免疫组化检测引产胎儿组织中PHGDH基因的表达水平;（4）制备PHGDH基因突变型及野生型过表达慢病毒,构建HEK293T稳转细胞株,应用Real-Time PCR检测PHGDH基因的转录水平变化,用Western blot检测PHGDH蛋白表达水平变化;（5）制备PHGDH基因突变型及野生型过表达慢病毒,构建HEK293T稳转细胞株,检测PHGDH的酶活性变化;（6）观察HEK293T细胞的增殖、细胞周期、凋亡及迁移的生物学行为变化。结果:1、对Neu-Laxova综合征家系进行突变基因检测后,发现PHGDH基因三个突变位点,其父亲携带突变位点c.488G＞A报道为致病突变,母亲携带突变c.607A＞T及c.743C＞T位点均未见致病报道。2、对PHGDH突变c.488G＞A,c.607A＞T及c.743C＞T进行生物信息学分析,结果提示突变型PHGDH的蛋白结构与野生型差异明显。3、引产胎儿各组织中PHGDH蛋白表达下降。4、将PHGDH基因突变型及野生型表达慢病毒感染至HEK293T细胞中后,可观察到PHGDH的转录水平上调,蛋白表达水无明显差异。5、酶功能实验提示PHGDH基因c.488G＞A及c.607A＞T复合突变使酶活性下降。6、PHGDH基因c.488G＞A及c.607A＞T复合突变,使HEK293T细胞增殖能力下降,细胞周期S期阻滞,细胞坏死增多,迁移能力降低。结论:1、PHGDH基因c.488G＞A及c.607A＞T复合杂合突变,是Neu-Laxova综合征患者发病的原因。2、PHGDH基因c.488G＞A及c.607A＞T复合杂合突变降低PHGDH酶活性,抑制细胞的增殖,阻滞细胞周期S期,促进细胞坏死,降低细胞的迁移能力。