目的:近年来,非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）的发病率在世界范围内呈现逐渐上升的趋势,是导致肝脏功能受损、肝硬化甚至肝癌的重要因素,未来可能会成为终末期肝病的主要原因。NAFLD主要特征为肝脏中甘油三酯的异常积累,从而进展为脂肪变性、脂毒性和炎症。NAFLD已知与2型糖尿病、高血压、心血管疾病等高度相关,发病率随年龄增长而增高,严重威胁老年人的健康。然而老年人群中NAFLD发生发展的分子机制仍然未知,深入探讨老年NAFLD发病机制寻找治疗靶点成为了越来越多人的关注目标。自噬是一种降解蛋白质和细胞器的重要分解代谢途径,参与脂滴中的脂质分解代谢过程。研究表明,自噬缺陷在NAFLD的发病机制及并发症中发挥核心作用。自噬不仅可以调节脂质代谢和胰岛素抵抗,还可以保护肝细胞免受损伤和死亡,自噬水平随年龄增长而降低,与衰老相关多种疾病关联。分子伴侣介导的自噬（chaperon-mediated autophagy,CMA）是自噬的三种主要类型之一,是能够促进细胞内蛋白质在溶酶体中降解的蛋白水解系统。CMA通过调节细胞内脂质储存动员从而在脂质滴（Lipid droplets,LDs）清除中发挥重要作用,并且是启动下游脂质降解机制的关键步骤。CMA功能下降在NAFLD疾病进展中发挥重要作用,并且随着生理老化而发生。Nur77是孤儿核受体（NR4A）超家族的转录因子,参与许多生物过程如炎症、细胞凋亡、自噬等。Nur77能够促进自噬,研究发现Nur77与自噬下游关键蛋白p62/SQSTM1之间存在强烈的特异性相互作用,泛素化的Nur77异位于线粒体,通过促进线粒体自噬的发生减轻肝脏炎症。Nur77亦是脂毒性传感器,能够通过多种信号途径调节肝脏脂质代谢过程。小鼠过表达Nur77后肝脏甘油三酯水平降低,相反敲除Nur77会增加胰岛素抵抗和肝脂肪变性。近年研究发现,Nur77也参与衰老相关疾病的发生发展,Nur77缺乏能够促进老年肥胖中的瘦素抵抗,并且与增龄性肾小管间质纤维化相关。然而Nur77在衰老相关的NAFLD进展中的作用尚不明确。本研究旨在通过构建Nur77缺失的自然衰老小鼠模型,探究Nur77对衰老小鼠肝脏脂质代谢的调控作用,并通过构建Nur77过表达及敲减的细胞模型观察Nur77对体外肝细胞脂质代谢的影响,试图从分子伴侣自噬的角度探讨Nur77促进肝细胞脂质分解的机制。研究方法:第一部分:Nur77调控老年小鼠肝脏脂代谢的作用评价研究1.建立自然衰老小鼠模型,雄性Nur77基因突变(Nur77-targeted mutant,Nur77-/-)及其同窝对照野生型（wide type,WT）C57BL/6J小鼠生活在12小时光照/12小时黑暗周期中,自由进食鼠粮及水,监测体重、二便、活动、毛发改变等一般情况,小鼠基因型鉴定。选取5月龄及15月龄组,称量体重,取肝脏组织,称量肝脏重量,计算肝指数（肝重/体重）。2.收集血液,分别检测血清甘油三酯（TG）,总胆固醇（TC）,谷丙转氨酶（ALT）,谷草转氨酶（AST）。检测肝脏组织TG含量。3.肝脏组织进行HE染色,油红O染色观察肝脏组织病理改变,透射电子显微镜观察肝脏超微结构改变。4.实时定量PCR检测脂代谢相关基因m RNA表达量。第二部分:Nur77调控CMA减轻肝脏脂质沉积的作用研究1.提取各组小鼠肝脏组织蛋白,Western Blot检测CMA通路LAMP2A-HSC70蛋白表达以及脂滴外膜蛋白PLIN2表达。2.体外培养人肝癌细胞株（Hep G2）,选择合适浓度棕榈酸（palmic acid,PA）作为细胞脂毒性的诱导因素。PA处理后检测Nur77蛋白表达水平。通过慢病毒感染Hep G2细胞分别构建Nur77过表达（Nur77OE）及敲减（sh Nur77）细胞模型,在给予PA刺激后检测各组细胞TG含量,细胞油红O染色检测脂滴积聚情况。在有无PA刺激下Western Blot检测CMA通路LAMP2A-HSC70及PLIN2蛋白表达。通过免疫荧光技术对体外肝细胞PLIN2蛋白表达量进一步验证。3.提取各组小鼠肝脏组织蛋白,Western Blot检测自噬通量关键蛋白p62、LC3表达,免疫荧光染色观察p62蓄积情况。4.Nur77过表达（Nur77OE）及敲减（sh Nur77）细胞模型在有无PA刺激下通过Western Blot检测自噬通量p62、LC3蛋白表达。第三部分:Nur77调控LAMP2A促进CMA降解肝细胞脂质的作用机制研究1.利用3个LAMP2A-si RNA片段对Hep G2细胞进行RNA干扰从而达到敲减蛋白作用,Western Blot验证敲减效率,选择敲减效率最高的LAMP2A-si RNA片段对Nur77过表达细胞进行转染。给予PA处理后,测定TG含量,进行油红O染色,免疫荧光技术检测PLIN2蛋白表达情况。2.Nur77过表达及其对照组的稳转细胞系转染LAMP2A-si RNA后,在PA刺激下Western Blot检测HSC70、PLIN2以及p62、LC3蛋白表达。3.应用q RT-PCR分别检测Nur77OE、sh Nur77及其各自对照组LAMP2A的m RNA表达。4.应用JASPAR网站预测Nur77结合序列元件在LAMP2启动子区域的结合位点。应用CHIP-q PCR检测Nur77对LAMP2转录活性的调控作用。结果:第一部分:Nur77调控老年小鼠肝脏脂代谢的作用评价研究1.15月龄组小鼠体重、肝脏重量、肝指数较5月龄组明显增加,其中5月龄组WT及Nur77-/-组之间无显著差异,而15月龄Nur77-/-组较WT组上述指标改变进一步加重。2.15月龄组小鼠血清甘油三酯（TG）,总胆固醇（TC）,谷丙转氨酶（ALT）,谷草转氨酶（AST）、肝脏TG含量较5月龄组明显增加,其中5月龄组WT及Nur77-/-组之间无显著差异,而15月龄Nur77-/-组较WT组上述指标改变进一步加重。3.肝脏HE染色及油红O染色显示,与5月龄小鼠相比,15月龄组出现脂肪空泡变性,脂质滴沉积,其中15月龄Nur77-/-组较WT组脂肪变性改变更为明显,透射电子显微镜下亦可见到15月龄Nur77-/-组脂质滴增加显著。4.各月龄WT及Nur77-/-组脂代谢相关基因ACC、FASN、ATGL、HSL、CPT1、PGC1-α的m RNA表达水平无明显差异。第二部分:Nur77调控CMA减轻肝脏脂质沉积的作用研究1.Nur77对老年小鼠CMA水平影响较为显著,与5月龄WT组相比,15月龄WT组LAMP2A蛋白表达下降,同时伴有PLIN2表达增高,而15月龄Nur77-/-组较WT组上述改变更加明显。HSC70蛋白表达水平在各组之间无差异。2.PA刺激Hep G2细胞能够使Nur77蛋白表达下降。细胞给予PA刺激后,Nur77敲减组较对照组TG含量增加,油红O染色脂滴积聚增加;而Nur77过表达后较对照组TG含量降低,油红O染色脂滴积聚减少。无论有无PA刺激,Nur77过表达能够使LAMP2A蛋白表达升高,而Nur77敲减后LAMP2A蛋白表达降低。但在PA刺激下,PLIN2蛋白表达升高,Nur77过表达后能够降低PLIN2蛋白表达,而在Nur77敲减后PLIN2蛋白表达进一步升高。各组之间HSC70表达无明显差异。免疫荧光结果进一步证实,在PA刺激下,Nur77敲减后PLIN2红色荧光增多,而Nur77过表达后能够部分逆转上述改变。3.Nur77影响老年小鼠自噬通量,Western Blot可见与5月龄WT组相比,15月龄WT组p62表达升高。15月龄Nur77-/-组较WT组p62及LC3II蛋白表达升高更为明显,免疫荧光可见15月龄WT组较5月龄WT组p62蓄积增加,而15月龄Nur77-/-组p62蓄积更为明显,提示存在自噬通量受阻。4.体外肝细胞在给予PA刺激后出现自噬通量受阻,表现为p62和LC3II蛋白表达升高,Nur77敲减后加重了自噬通量受阻,进一步上调p62和LC3II蛋白表达,而Nur77过表达后能够部分逆转自噬通量受阻。第三部分:Nur77调控LAMP2A促进CMA降解肝细胞脂质的作用机制研究1.在Nur77过表达情况下转染si RNA-LAMP2A对LAMP2A进行敲减后,发现LAMP2A敲减后加重了肝细胞的脂质沉积,油红O染色可见肝细胞脂质滴增加,细胞TG含量升高,免疫荧光可见PLIN2红色荧光增多,在LAMP2A敲减情况下即使Nur77过表达仍然不能逆转上述改变。2.当Nur77过表达组细胞进行LAMP2A敲减后,Nur77对PLIN2蛋白高表达以及自噬通量受阻的逆转作用基本消失。3.q RT-PCR结果提示:Nur77敲低能降低LAMP2A的m RNA表达水平,而Nur77过表达能够升高LAMP2A的m RNA表达水平。4.JASPAR网站预测,在LAMP2转录起始位点上游2000个序列和下游500个序列的位置存在2个评分较高的Nur77结合位点,分别是+984（P1）和+860（P2）。CHIP-q PCR结果提示Nur77能够与LAMP2转录起始位点前的P1、P2 DNA序列结合。结论:衰老能够导致肝脏脂代谢异常,而Nur77缺失能够进一步加重老龄小鼠肝脏脂质沉积及肝功能损伤。Nur77是LAMP2的上游核转录因子,通过转录调控LAMP2A的表达,激活CMA降解PLIN2同时促进自噬通量,促进衰老肝细胞脂肪分解。