研究背景及目的:IgA肾病（Immunoglobulin A nephropathy,IgAN）,作为导致慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）中最常见的原发性肾小球疾病,已经越来越受到人们的重视。缓慢且隐匿的病情进展最初使得人们误认为其预后良好,然而据统计高达40%的IgAN患者会进展成为终末期肾病（End-stage renal disease,ESRD）。本病被Jacques Berger首次报道已经过去50多年,但其发病机制至今仍未完全阐明。加之患者肾小球内IgA沉积密度与损伤程度的非平行性以及临床表现的显著差异性,导致目前仍无明确的治疗方案。在有关IgAN的发病机制研究中,“多重打击”学说已被绝大多数肾脏学者认可。但在“多重打击”中仅最后一步“打击”发生于肾小球内,即含有半乳糖缺陷的多聚IgA1免疫复合物与肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell,MC）表面的转铁蛋白受体（Transferrin receptor,Tf R）结合并激活MC,导致细胞异常增殖,增殖的MC合成过多的细胞基质,并释放出炎症因子、趋化因子等以串扰的方式影响足细胞、肾小管细胞的功能。由此看来,MC作为IgAN发生和发展过程中首当其冲的肾小球固有细胞,抑制甚至逆转MC的增殖是治疗IgAN的有效途径之一。目前已有的研究显示在IgAN中,丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase,MAPK）信号通路在肾小球内过度激活促进了MC的增殖并加重了疾病的进展,亦有报道显示通过抑制肾小球内MAPK信号通路的过度激活可起到治疗作用。槐杞黄是一种由槐耳（Trametes robiniophila Murr,Huaier,HR）、枸杞（Wolfberry fruit）、黄精（Polygonatum）三种中草药组成的中药复方,已在多项临床研究中显示单用或联合其他药物对IgAN患者可起到治疗作用。槐耳作为槐杞黄的主要成分之一,已被证实能够对多种靶基因进行调控及修复,亦有研究表明槐耳可通过调控MAPK信号通路抑制肿瘤细胞的增殖。上述背景提示在IgAN中,槐耳有可能通过其靶基因调控MC中的MAPK信号通路进而发挥抑制细胞增殖的作用。高效率的生物信息分析技术已成为一种筛选疾病关键基因的手段,通过此方法可挖掘疾病生物标志物、探究发病机制、寻找治疗靶点。本研究的目的旨在通过生物信息分析技术挖掘IgAN发生和发展过程中的关键基因,通过实验验证关键基因DUSP1的表达,并探寻DUSP1调控系膜细胞增殖以及槐耳干预抑制系膜细胞增殖的新机制,为IgAN的发病机制探究和临床治疗提供新的理论依据。研究方法:一、生信分析筛选IgAN发生发展过程中的关键基因及体内实验验证:1.在公共数据库GEO中选取IgAN数据集GSE93798、GSE99339、GSE50469和GSE37460。将数据集GSE93798、GSE99339和GSE50469合并作为训练集,通过一系列分析筛选关键基因,在验证集（数据集GSE37460）中对关键基因进行验证。2.应用牛血清蛋白+四氯化碳+脂多糖的方法建立经典的SD大鼠IgAN模型,分组为:（1）对照组（Control组）;（2）模型组（IgAN组）。3.应用HE和PAS染色观察肾组织病理形态、IgA直接免疫荧光观察肾小球内荧光强度及BCA法测定24尿蛋白定量验证IgAN大鼠模型。4.应用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-q PCR）法、蛋白免疫印迹（Western Blot）法和免疫组化（IHC）法检测肾小球内DUSP1的m RNA和蛋白表达差异。5.应用免疫荧光双染法双染DUSP1和integrin-α8检测DUSP1在肾小球内的表达定位。二、DUSP1调控人肾小球系膜细胞增殖的机制研究:1.应用多聚IgA1（p IgA1）建立IgAN系膜细胞疾病模型。分组为:（1）正常培养组（Control组）;（2）细胞疾病模型组（p IgA1组）。2.应用细胞免疫荧光法Ki67染色验证细胞疾病模型。3.应用RT-q PCR法和Western Blot法检测Control组和p IgA1组中DUSP1的m RNA和蛋白表达差异。4.对人肾小球系膜细胞（HMC）进行DUSP1过表达慢病毒转染,分组为（1）过表达阴性对照组（Oe-Con组）;（2）过表达DUSP1组（Oe-DUSP1组）。5.应用CCK8法检测过表达DUSP1对细胞增殖的影响。6.应用流式细胞分析技术和Western Blot法检测过表达DUSP1对细胞周期及凋亡的影响。7.应用Western Blot法检测过表达DUSP1对MAPK信号通路及p53、p21表达的影响。三、槐耳菌质通过DUSP1调控系膜细胞增殖的机制研究:1.建立槐耳（HR）干预IgAN的大鼠模型,分组为:（1）对照组（Control组）;（2）模型组（IgAN组）;（3）模型+槐耳干预组（IgAN+HR组）。2.应用HE和PAS染色观察肾组织病理形态、IgA直接免疫荧光观察肾小球内荧光强度及BCA法测定24尿蛋白定量验证HR对IgAN大鼠模型的干预效果。3.应用Western Blot法和IHC法观察HR干预对肾小球内DUSP1的表达影响。4.应用CCK-8法检测HR干预HMC的IC50。5.建立HR干预IgAN的系膜细胞疾病模型,分组为:（1）正常培养组（Control组）;（2）疾病模型组（p IgA1组）;（3）模型+槐耳干预组（p IgA1+HR组）。6.应用CCK8和Western Blot法检测HR干预对细胞疾病模型增殖的影响。7.应用Western Blot法检测HR干预对细胞疾病模型DUSP1表达的影响。8.对HMC进行DUSP1敲减慢病毒转染,分组为（1）敲减阴性对照组（Sh-Con组）;（2）敲减阴性对照+HR干预组（Sh-Con+HR组）;（3）敲减DUSP1+HR干预组（Sh-DUSP1+HR组）。9.应用流式细胞分析技术和Western Blot法检测HR是否通过DUSP1调控细胞周期及凋亡。10.通过Western Blot法检测HR是否通过DUSP1调控MAPK信号通路及p53、p21的表达。研究结果:第一部分:1.通过对训练集的分析及验证集的验证共筛选出关键基因2个,选定DUSP1进行后续实验。2.HE及PAS染色、IgA直接免疫荧光及24小时尿蛋白测定结果证实IgAN大鼠模型建立成功。3.IHC、RT-q PCR及Western Blot结果显示IgAN组大鼠肾小球内DUSP1的蛋白和m RNA表达均下调。4.免疫荧光双染DUSP1及integrin-α8结果显示在肾小球系膜细胞中存在DUSP1的表达定位。第二部分:1.RT-q PCR及Western Blot结果显示DUSP1的m RNA及蛋白表达在细胞疾病模型中均下调。2.CCK8结果显示过表达DUSP1引起HMC细胞增殖抑制。3.流式细胞周期检测和Western Blot结果显示过表达DUSP1引起HMC的G0/G1期细胞比例增加;CDK2和Cyclin D1的表达下调。4.流式细胞凋亡检测和Western Blot结果显示过表达DUSP1导致细胞凋亡比例增加;Bax、cleaved-Caspase3的表达上调,Bcl2的表达下调。5.Western Blot结果显示过表达DUSP1下调HMC中p-ERK/t-ERK、p-JNK/t-JNK、p-P38/t-P38的表达;而上调p53和p21的表达。第三部分:1.HR干预后IgAN大鼠模型肾小球内细胞数量及基质成分均减少、IgA荧光强度减弱、24小时尿蛋白量减少。2.IHC及Western Blot结果显示HR干预上调IgAN大鼠模型肾小球内DUSP1的表达。3.CCK-8及Western Blot结果显示HR干预下调细胞疾病模型中PCNA的表达量,抑制p IgA1诱导的细胞增殖。4.Western Blot结果显示HR干预上调细胞疾病模型中DUSP1的表达。5.流式细胞周期检测结果显示敲减DUSP1可减弱HR干预引起的G0/G1期细胞比例增加;Western Blot结果显示敲减DUSP1可减弱HR干预引起的CDK2和Cyclin D1的表达下调。6.流式细胞凋亡检测结果显示敲减DUSP1可减弱HR干预诱导的细胞凋亡比例增加;Western Blot结果显示敲减DUSP1可减弱HR干预引起的Bax、cleaved-Caspase3表达上调及Bcl2表达下调。7.Western Blot结果显示敲减DUSP1可减弱HR干预引起的p-ERK/t-ERK、p-JNK/t-JNK及p-P38/t-P38的表达下调。8.Western Blot结果显示敲减DUSP1可减弱HR干预引起的p53和p21表达上调。研究结论:1.通过对IgAN的基因芯片数据集的分析,筛选出DUSP1为IgAN发生发展过程中的关键基因,体内实验证实DUSP1在IgAN大鼠模型的肾小球内表达下调,且系膜细胞中存在DUSP1的表达。2.体外实验中证实DUSP1在IgAN系膜细胞疾病模型中表达下调,在系膜细胞中过表达DUSP1可引起细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡进而抑制细胞增殖,并抑制MAPK信号通路及上调p53、p21的表达。3.体内体外实验证实HR干预可上调DUSP1的表达,证实DUSP1为槐耳的新的靶基因。体外实验证实HR通过DUSP1引起系膜细胞周期阻滞并诱导细胞凋亡、抑制MAPK信号通路及上调p53和p21的表达。HR上调DUSP1的表达后可能是通过抑制MAPK信号通路及上调p53、p21的表达进而抑制系膜细胞增殖。