【摘 要】
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目的:通过体外培养的大鼠脑微血管内皮细胞与外源性高迁移率族蛋白B1（HMGB1）及髓鞘碎片共同培养以模拟脊髓损伤后血脊髓屏障（BSCB）中内皮细胞的损伤环境。观察HMGB1对髓鞘碎片介导下大鼠脑微血管内皮细胞吞噬情况变化时细胞黏附功能的变化情况,探讨HMGB1对髓鞘碎片介导的大鼠血脊髓屏障中内皮细胞黏附功能的作用及机制方法:第一部分:观察外源性HMGB1与髓鞘碎片共同培养后大鼠脑微血管内皮细胞黏附
【基金项目】
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国家自然科学基金“HMGB1/TLR4通路调节血脊髓屏障功能对大鼠脊髓损伤后脊髓离子性水肿与血管源性水肿的作用及其分子机制”（编号81870976）2019年1月-2022年12月；
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目的:通过体外培养的大鼠脑微血管内皮细胞与外源性高迁移率族蛋白B1（HMGB1）及髓鞘碎片共同培养以模拟脊髓损伤后血脊髓屏障（BSCB）中内皮细胞的损伤环境。观察HMGB1对髓鞘碎片介导下大鼠脑微血管内皮细胞吞噬情况变化时细胞黏附功能的变化情况,探讨HMGB1对髓鞘碎片介导的大鼠血脊髓屏障中内皮细胞黏附功能的作用及机制方法:第一部分:观察外源性HMGB1与髓鞘碎片共同培养后大鼠脑微血管内皮细胞黏附功能的影响。取7-10天的SD大鼠的脑微血管内皮细胞,建立外源性HMGB1与髓鞘碎片的共同培养模型。实验分为五组:正常组（正常培养的大鼠脑微血管内皮细胞,不做处理）;12h组（大鼠脑微血管内皮细胞中同时添加外源性HMGB1与髓鞘碎片）;24h组（大鼠脑微血管内皮细胞中同时添加外源性HMGB1与髓鞘碎片）;48h组（大鼠脑微血管内皮细胞中同时添加外源性HMGB1与髓鞘碎片）;72h组（大鼠脑微血管内皮细胞中同时添加外源性HMGB1与髓鞘碎片）。免疫蛋白印迹技术（Western blot）检测各组大鼠脑微血管内皮细胞中细胞间黏附分子-1（ICAM-1）,以及反映内皮细胞吞噬髓鞘碎片情况的蛋白:髓鞘碎片的标记蛋白髓鞘碱性蛋白（MBP）、组织蛋白酶D（Cat D）蛋白的表达情况。使用免疫荧光技术（IF）检测各组大鼠脑微血管内皮细胞中ICAM-1、MBP、Cat D蛋白的表达情况。第二部分:观察外源性HMGB1添加与否对大鼠脑微血管内皮细胞黏附功能的影响。通过第一部分的实验结果得到相关蛋白表达最多的时间点。通过只添加髓鞘碎片以及使用HMGB1提前处理的内皮细胞来观察外源性HMGB1是否会发挥作用。实验分四组:正常组,HMGB1添加组,HMGB1未添加组,HMGB1预处理组（内皮细胞添加外源性HMGB1预处理24h后添加髓鞘碎片）。通过western blot及IF检测上述四组中ICAM-1、MBP、Cat D蛋白的表达情况.第三部分:在同时添加HMGB1与髓鞘碎片后,添加TLR4与NF-ΚB的抑制剂来检测HMGB1通过TLR4/NF-ΚB（Toll样受体4/核转录因子-ΚB）通路对髓鞘碎片介导大鼠脑微血管内皮细胞黏附及吞噬功能进行调节。实验分为四组:正常组,模型组,TLR4抑制组,NF-ΚB抑制组。Western blot检测上述四组中大鼠脑微血管内皮细胞中的ICAM-1、MBP、Cat D蛋白的表达情况,以及TLR4与NF-ΚB的蛋白表达情况结果:第一部分实验结果:观察外源性HMGB1与髓鞘碎片同时添加后大鼠脑微血管内皮细胞黏附功能的影响。WB结果显示与未进行任何处理的正常培养的大鼠脑微血管内皮细胞相比,同时添加外源性HMGB1与髓鞘碎片的内皮细胞ICAM-1的表达量增高（P＜0.05）,而且在同时添加外源性HMGB1与髓鞘碎片的内皮细胞共同24h后表达量达到最多。同时反映细胞吞噬情况的蛋白表达也明显增多,其中髓鞘碱性蛋白（MBP）表达含量随培养时间延长而增多,表达量达到最多的时间点在共同培养后24h,同时细胞吞噬的标志蛋白Cat D蛋白表达含量亦随培养时间的延长也呈上升趋势,且与正常组存在明显差异（P＜0.05）,而且持续培养24h是其表达量最多的时间点。此外,经过免疫荧光检测上述蛋白的表达量,已具有相似的实验结果。第二部分:观察外源性HMGB1添加与否对髓鞘碎片介导的大鼠脑微血管内皮细胞黏附功能的影响。WB结果表明:与HMGB1添加组相比,HMGB1未添加组ICAM-1,MBP,Cat D蛋白的表达减少（P＜0.05）,而HMGB1预处理组与HMGB1添加组相比蛋白表达量无明显差异（P＞0.05）,差异无统计学意义.而且,IF检测也具有相似的实验结果.第三部分,同时添加HMGB1与髓鞘碎片后,添加TLR4与NF-ΚB的抑制剂来检测HMGB1通过TLR4/NF-ΚB（Toll样受体4/核转录因子-ΚB）通路对大鼠脑微血管内皮细胞黏附及吞噬功能进行调节。Werstern blot结果表明,与HMGB1添加相比TLR4抑制剂（CLI095）组及NF-Κb（BAY11-7082）抑制剂组ICAM-1,MBP,Cat D蛋白的表达减少（P＜0.05）,此外,相应的通路蛋白TLR4蛋白与NF-ΚB蛋白表达也减少（P＜0.05）。结论:1.HMGB1能够促进大鼠内皮吞噬髓鞘碎片,从而促进内皮细胞表达细胞间黏附分子-1（ICAM-1）。因此,我们可知HMGB1促进髓鞘碎片介导的的BSCB内皮细胞ICAM-1表达增多,促进外周免疫细胞募集。2.HMGB1可通过TLR4/NF-ΚB通路调节髓鞘碎片介导的大鼠内皮细胞吞噬髓鞘碎片,同时调节内皮细胞的黏附功能。
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