论文部分内容阅读
研究背景及意义登革病毒（Dengue virus,DENV）是黄病毒家族属的一种主要由埃及伊蚊和白纹伊蚊进行叮咬传播的虫媒病毒,可引起人类登革热,登革出血热及登革休克综合征。目前登革病毒被世界卫生组织视为热带及亚热带地区的重大公共卫生问题。全球每年约有3.9亿人次感染登革,每5000万～1亿感染者中就有约2万人死亡。虽然针对登革病毒的疫苗研究已开展近70年,但目前尚无安全有效的登革病毒疫苗或相关的治疗性药物。法国赛诺菲-巴斯德公司研制的登革病毒4价减毒活疫苗曾在2015年获美国（Food and Drug Administration,FDA）批准上市,但因在菲律宾开展Ⅲ期临床试验时出现严重的不良反应而被叫停。因DENV主动免疫疫苗研究进展缓慢,故人们将目光聚焦于DENV的被动免疫治疗及治疗性抗体的相关研究。而单克隆抗体（Monoclonal antibodies,mAb）作为一种技术成熟、特异性强、治疗效果较好的被动免疫策略,逐渐成为了人们研究的热点。我们采用4种血清型DENV联合免疫小鼠,最大限度保留各血清型DENV蛋白的天然免疫活性,利用小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合,筛选并制备针对4种血清型DENV的交叉反应性单克隆抗体,鉴定其特异性并评价其中和能力,以期为DENV的被动免疫治疗、疫苗的研发以及登革病毒临床诊断方面提供一定的物质基础和相关信息。研究方法（1）我们采用4种血清型的DENV联合免疫BALB/c小鼠,末次加强免疫1周后,尾静脉取血分离血清,采用间接法酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测免疫小鼠的血清抗体效价,挑选对4种血清型DENV都具有较强抗体反应的小鼠作为后续杂交瘤细胞制备的脾细胞供体。（2）分离脾细胞供体小鼠血清作为阳性对照,无菌分离脾脏后,将脾细胞与处于对数生长期的SP2/0细胞按1:5的比例在聚乙二醇（Polyethylene Glycol 2000,PEG2000）的作用下进行细胞融合,形成杂交瘤细胞。（3）采用有限稀释法对融合后的杂交瘤细胞进行阳性亚克隆的筛选,并通过间接法ELISA对亚克隆后各孔内的单细胞集落培养上清进行抗体效价检测,直至所有板孔内细胞培养上清检测阳性率为100%时,即可定株。通过间接法ELISA挑选对4种血清型DENV都具有较强抗体反应的细胞株进行后续腹水抗体的制备、纯化及特异性鉴定。（4）采用腹水诱生法制备BALB/c小鼠腹水抗体,并通过蛋白A亲和层析法对腹水抗体进行纯化。采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）电泳对纯化前后腹水抗体进行比较,BCA法检测纯化抗体的蛋白浓度。（5）应用小鼠单抗免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）类/亚类鉴定试剂盒对纯化单抗的Ig亚类进行鉴定。（6）通过间接法ELISA检测纯化单抗对4种血清型DENV的有效滴度。（7）通过硫氰酸盐洗脱法测定纯化单抗对4种血清型DENV的相对亲和力常数。（8）通过间接免疫荧光（Indirect immunofluorescence assay,IFA）、蛋白质印迹（Western Blot,WB）评价纯化单抗的特异性。（9）通过噬斑减少中和试验（Plaque Reduction Neutralization Test,PRNT）评价纯化单抗的中和能力。结果（1）免疫小鼠血清抗体效价均显著高于未免疫小鼠,10只免疫小鼠对4种血清型DENV的平均抗体效价约为1:250000,根据实验结果,挑选141号小鼠作为后续细胞融合的脾细胞供体。（2）细胞融合共铺96孔板1块,细胞融合率为56%,阳性率为27%。经阳性亚克隆的筛选,成功获得3株DENV交叉反应性mAb,分别命名为1G2、2F1、3G9。根据细胞培养上清抗体效价检测结果,挑选1G2号杂交瘤细胞株进行后续腹水抗体的制备、纯化及特异性鉴定。（3）腹水抗体经Protein A亲和层析柱纯化后,SDS-PAGE电泳凝胶中可见明显的抗体蛋白重链（55kD）与轻链（25kD）条带。经BCA法检测纯化单抗的蛋白浓度为3.0mg/ml。（4）经检测1G2号单抗的Ig亚类为IgG2b,纯化后单抗对DENV1～DENV4的有效滴度分别为1:640、1:640、1:320和1:320;对DENV1～DENV4的相对亲和力常数分别为3mol/L、3mol/L、3mol/L和2.5mol/L。（5）间接免疫荧光染色结果显示在4种DENV感染的vero细胞中可见明显的细胞质绿色荧光,而在未感染的vero细胞中无任何绿色荧光出现,表明1G2号单抗是针对DENV的特异性抗体,而不是针对vero细胞相关蛋白成分的抗体。而在黄热病毒（Yellow fever virus,YFV）、西尼罗河病毒（West Nile virus,WNV）、丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）和寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）感染的vero细胞中,无明显的绿色荧光出现,表明1G2号单抗与黄病毒家族其他成员之间无交叉反应性。（6）WB结果显示1G2号单抗与4种DENV感染48h后的vero细胞裂解液在约55-60kD位置出现明显的目的条带,根据DENV各组成蛋白分子量大小的比较,推测1G2号单抗识别目的蛋白应该是E蛋白;进一步我们采用经原核表达的4种血清型DENV重组E蛋白与单抗1G2进行WB实验,表明1G2号单抗识别目的蛋白确实是DNEV的E蛋白;再通过与2019重庆DENV-1、YFV、WNV、HCV和ZIKV进行WB实验,表明1G2号单抗能够能够识别其他株的DENV,而且与YFV、WNV、HCV和ZIKV之间无交叉反应性。（7）噬斑减少中和试验结果表明单抗1G2对4种血清型DENV在体外具有一定的中和活性,DENV1至DENV4的PRNT50分别为1:80、1:80、1:80和1:40。结论成功筛选并鉴定到一株可交叉识别4种血清型DENV的mAb 1G2,其Ig亚类为IgG2b,识别的目的蛋白为DENV的E蛋白,具有高度特异性,与黄病毒家族成员YFV、WNV、HCV、ZIKV之间无交叉反应性;对DENV1～DENV4的有效滴度分别为1:640、1:640、1:320、1:320;体外实验中显示出一定的中和活性,对DENV1至DENV4的PRNT50分别为1:80、1:80、1:80和1:40。