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研究目的:肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是全球范围内普遍存在的人类恶性肿瘤之一,具有很高的发病率和死亡率。在我国的恶性肿瘤发病构成中,肝癌所占的比例始终居高不下。同时,由于其具有极强的迁移和侵袭能力,手术切除和肝移植效果并不理想。因此,探寻调控HCC转移的分子机制对于确定新的治疗靶标至关重要。氨肽酶N(Aminopeptidase N,APN,也被称为CD13)是一种多功能的外肽酶,已有的研究证明该蛋白与多种癌症的转移和增殖相关,但其在肝细胞癌发展进程中发挥的功能尚不明确。这项研究旨在确定APN在HCC转移和增殖中的作用及其潜在机制。研究方法:1.应用肝癌组织芯片,分析肝癌组织和癌旁组织之间APN表达差异,及各项临床指标与APN表达水平的关系。并通过流式细胞术、酶活性检测、实时定量PCR及Transwell等实验技术检测不同肝癌细胞系中APN含量与转移能力的关系。2.构建敲除和过表达APN的肝癌细胞系,通过Transwell迁移和侵袭实验对比APN对肝癌细胞在体外转移能力的影响。建立NOD/SCID小鼠的肝癌转移动物模型,分析APN在实验动物体内对肝癌转移的作用。应用小鼠肝原位移植瘤模型观察APN对模型动物生存时间的影响。3.测定干预细胞内APN表达水平后,肝癌细胞在体外的克隆形成和抗凋亡能力变化。建立NOD/SCID小鼠的皮下异种移植瘤模型,分析APN水平对实验动物体内肝癌细胞增殖能力的影响。4.转录组测序(RNA Sequencing)技术分析肝癌细胞敲除APN后基因转录水平、通路激活以及生物学功能的改变。通过免疫印迹、Transwell迁移和侵袭以及克隆形成等体外实验,对RNA-seq分析结果进行验证。5.通过磷酸化蛋白质组学技术筛选敲除APN的肝癌细胞磷酸化水平发生变化的蛋白。通过点突变和蛋白印迹实验验证支链α-酮酸脱氢酶激酶(Branched-chain alpha-ketoacid dehydrogenase kinase,BCKDK)磷酸化位点的功能。使用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)和邻位连接技术(Proximity ligation assay,PLA,也称为Duolink实验),分析BCKDK与ERK1/2之间的相互作用关系。最后,通过小鼠肝原位移植瘤模型观察APN介导的BCKDK磷酸化在肝癌增殖和转移中的作用。研究结果:研究发现APN在HCC肿瘤组织和高转移性肝癌细胞系中常表现为上调趋势。在体外和体内实验中,敲除APN均可抑制HCC细胞的转移和增殖。机制研究表明,APN的敲除会抑制HCC细胞中的ERK信号通路的激活。APN能够介导BCKDK的第31位丝氨酸的磷酸化,促进BCKDK与ERK1/2相互作用并使后者磷酸化水平升高,从而激活HCC细胞中的ERK信号传导途径,促进肝癌转移和增殖。研究结论:本研究结果表明,APN能够介导BCKDK第31位丝氨酸的磷酸化,进而激活下游的ERK信号通路,促进HCC增殖和转移。因此,APN/BCKDK/ERK信号轴将可能作为HCC治疗的新靶标,并有助于发现HCC疾病进展中新的标志物。