论文部分内容阅读
1国产不同类型基因工程猪到猕猴异种肾移植体内实验研究【目的】1、在国内首次使用中国自主研发的不同类型基因工程猪,用于猪到猕猴异种肾移植实验研究,探讨在采用临床可行的免疫抑制方案下猪到非人灵长类动物异种肾移植是否可以达到移植物长期存活。2、在上述临床可行的免疫抑制方案的基础上,加用国际上报道的能显著延长异种肾移植存活时间的抗CD154抗体,研究该方案能否进一步改善异种肾移植效果。【方法】分别使用以下几种国产基因编辑猪（小型巴马猪）作为供体:1)GTKO/h CD55猪;2)GTKO/h CD55/TM/EPO猪;3)GTKO/β4Gal NT2KO/CMAHKO/h CD55猪;4)GTKO/β4Gal NT2KO猪;5)GTKO/β4Gal NT2KO/CD55/TM猪。采用经供体猪PBMCs筛选的异种天然抗体水平较低的猕猴作为受体,行猪到猕猴异种肾移植术,并切除受体自体双肾。术后分别采用抗CD20单抗、兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白（r ATG）、甲强龙（MP）预防排斥治疗及使用Tac/Cs A+MMF+Pred维持治疗的临床可行免疫抑制方案（Group 1）,或采用在以上方案基础上加用抗CD154抗体的特殊免疫抑制方案（Group 2）进行预防排斥治疗。观察并比较不同用药方案下异种移植物生存时间,同时观察2组受体存活期间血生化、血常规、凝血功能、尿蛋白等相关生理指标。最后,对移植物进行常规HE、石蜡切片免疫组化和冰冻切片免疫荧光染色等病理学研究,对受体猕猴不同时间点血清进行异种抗体水平检测及淋巴毒试验,探究异种移植物失功的原因。【结果】成功实施了12例基因编辑猪到猕猴的异种肾移植,其中5例采用临床可行的常规免疫抑制治疗方案（Group 1）,7例采用加用抗CD154抗体治疗的方案（Group 2）。12例移植肾均未发生超急性排斥反应,关腹前移植肾均颜色、质地及泌尿正常,且至少术后一周内移植肾功能能维持正常。12例移植肾存活时间均在14天以上,Group1存活18～32天（18,19,20,25,32天）,Group 2存活14～30天（14,14,16,24,24,27,30天）。2组移植物存活时间无显著性差异（Mean:22.8±5.8天vs,21.29±6.55天,p=0.344）。12例受者中有3例术后出现了新生异种抗体水平的明显上升（Group 1:2例,Group 2:1例）,此3例病理结果提示为:移植肾和输尿管明显的出血、淤血以及广泛的毛细血管微血栓的形成,免疫荧光有明显的C3c、C4c、C5b-9、Ig M、Ig G沉积,免疫组化提示有T细胞的少量浸润和巨噬细胞的广泛浸润,表现为典型的急性体液性异种移植物排斥反应。其余9例虽未有循环中显著的新生抗体产生,但是病理表现仍与异种抗体水平显著升高的3例类似,程度相对较轻,表现为非典型的轻度急性体液性排斥反应。2组间的病理表现无明显差异。此外,所有受体术后均出现了血清碳酸氢和钠离子水平的升高、血红蛋白水平的下降,提示猪肾在维持猕猴内环境平衡方面的功能可能还存在一定问题。【结论】通过删除一种或多种异种抗原及转入人补体调节蛋白CD55的基因编辑策略改造供体猪,并采用临床可行的免疫抑制方案能成功克服猪到猕猴异种肾移植超急性排斥反应的发生,但是还难以达到移植物的长期存活。加用抗CD154抗体治疗并未进一步改善异种移植效果。移植肾失功的原因主要与新生异种抗体介导的免疫损伤及凝血异常导致的广泛血栓形成有关。未来仍需要通过更多的体内外实验挖掘新的异种抗原以及新的转基因策略,寻找更合适的基因编辑猪类型和抗排斥治疗方案。2天然和诱导的抗Sda抗体在GTKO猪到猕猴异种移植中的重要作用【目的】Sda由B4GALNT2酶产生,被认为是猪到非人灵长类动物异种移植中的重要异种抗原。然而,关于Sda在猪体内的表达及其在异种移植中的免疫原性却知之甚少。鉴于此,我们设计了相关体外实验研究天然和诱导抗Sda抗体在GTKO猪到猕猴异种移植中的作用。【方法】分离野生型（wildtype,WT）、GTKO（Sda高、中、低表达）、GTKO/β4Gal NT2KO、GTKO/CMAHKO、GTKO/CMAHKO/β4Gal NT2KO猪PBMC。使用20人/猴混合血清分别与以上几种基因编辑类型猪PBMC行CDC和Ig M/Ig G抗体结合,并用流式检测。【结果】与野生型猪（n=12）相比,GTKO猪（n=17）外周血单核细胞上的Sda的平均表达水平显著高于野生型猪,且GTKO猪组内Sda表达存在较大的个体差异。随着Sda表达水平的下降,混合猴血清与GTKO猪PBMC的Ig M/Ig G抗体和CDC水平均显著降低,呈现明显的量效关系。在进一步删除Sda后,混合猴血清与GTKO/β4Gal NT2KO猪PBMC的Ig M/Ig G抗体和CDC水平进一步降低。不同于猴血清,在Neu5Gc缺失后,混合人血清与GTKO猪PBMC的Ig M/Ig G抗体和CDC水平显著降低。此外,研究还提示,在GTKO/h CD55猪到猕猴肾移植术后产生体液性排斥反应的2只受体中,其血清中的非gal抗体50%以上是抗Sda抗体。且抗sda抗体对GTKO猪细胞具有明显的细胞毒性。【结论】天然和诱导的抗sda抗体在GTKO猪到猕猴异种移植中都发挥着重要作用,这为GTKO/β4Gal NT2KO猪作为异种移植临床前模型的首选器官来源提供了进一步的证据。