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目的:基于骨质疏松动物模型探讨川续断水煎液对去势骨质疏松模型大鼠BMP-2信号通路的影响,为中医药调控骨代谢、防治骨质疏松症的发生提供一定的理论依据。
方法:取6月龄健康SD大鼠40只,雌性,体重(240±20)g,称重后随机分组、编号,共4组:空白对照组(n=10)、模型组(n=10)、西药组(n=10)、川续断水煎液组(n=10)(20g/Kg.d)分笼喂养。首先各组大鼠经腹腔注射5%水合氯醛(用量:0.7ml/100g)达到麻醉效果后,沿下腹正中线作长2cm切口,逐层切开,暴露腹腔,找到输卵管后确认双侧卵巢,除空白对照组不作任何处理外,其余各组结扎卵巢血管后除净双侧卵巢,再依次逐层缝合至皮肤并再次消毒;术后3天所有大鼠均臀部肌肉注射青霉素5万单位,每日1次,以预防感染,正常喂养8周,经双能X线确认造模成功后,第9周起开始给药,每组根据实验设计给予不同的药物进行喂养,即空白对照组不灌胃,西药阿仑膦酸钠组在标准饲料常规喂养的同时每天灌服阿仑膦酸钠悬剂8周,川续断水煎液组继续用标准饲料喂养的同时每天灌服川续断水煎液8周,模型组给予同等剂量的生理盐水灌胃,灌胃8周后,四组大鼠于术前24小时禁食,待麻醉满意后,腹主动脉采血测大鼠血清生化指标,同时取大鼠双侧股骨头并剔除周围软组织制作股骨头组织病理学标本,并利用RT-PCR技术测骨组织中的BMP-2、CREB基因表达水平,所有实验数据采用SPSS19.0医学统计分析软件包对数据进行分析和处理。
结果:(1)去势造模组(去势模型组、去势西药组、去势川续断水煎液组)大鼠双侧股骨骨密度明显低于正常组,具有显著性差异(P<0.05),显示去卵巢8周后去势骨质疏松大鼠模型造模成功;(2)血清生化检测指标显示,与正常组相比模型组中与破骨细胞活性相关的指标抗酒石酸酸性磷酸酶水平升高,而与成骨细胞活性相关的指标血清碱性磷酸酶水平降低,#&P、*#P均<0.05;差异具有统计学意义;川续断组与模型组相比,**P、&&P均<0.05,川续断组与西药组相比,**P、&&P均>0.05,无统计学意义;(3)骨组织病理切片染色发现,正常组骨小梁分布规则,细胞分布均匀,空骨陷窝较少见,骨陷窝内细胞均匀分布;模型组细胞结构紊乱,骨小梁稀疏、断裂、变细,骨陷窝空虚扩大;川续断水煎液组骨组织形态学较模型组发生明显改变,单位面积内骨小梁的体积增加、增宽,排列明显变规则,空骨陷窝较少;西药组变化大致与中药组接近;(4)采用RT-PCR检测BMP-2、CREB的基因表达情况,经组间多重比较发现:BMP-2基因表达川续断组与西药组相比P=0.065(P>0.05),组间无统计学意义;川续断组与模型组相比P=0.02(P<0.05),具有统计学意义,说明川续断能够提高骨质疏松大鼠骨组织中BMP-2的表达水平,具有明显的抗骨质疏松作用;川续断组与正常组相比P=0.032(P<0.05),差异具有统计学意义;模型组与正常组相比P=0.38919(P>0.05),差异无统计学意义;西药组与正常组相比P=0.536(P>0.05)。CREB基因表达正常组与模型组相比P=0.364(P>0.05),差异无统计学意义;川续断组与正常组相比P=0.029(P<0.05);川续断组与模型组相比P=0.007(P<0.05);川续断组与西药组相比P=0.019(P<0.05),差异具有统计学意义;这说明川续断可增强CREB(cAMP反应元件)的转录活性,从而促进成骨细胞的分化以及其他成骨因子的表达,进而干预骨质疏松症的发生。
结论:(1)两种治疗药物均能提高大鼠骨组织中的BMP-2表达水平,且两组药物组间比较差异不明显,无统计学意义;这说明川续断可通过BMP-2信号通路调控骨代谢动态平衡,通过提高骨组织中的BMP-2表达,达到其诱导成骨分化的目的,从而发挥其抗骨质疏松的作用。(2)川续断能提高大鼠骨组织中的CREB水平,而西药阿伦磷酸钠确表现不明显,而阿伦磷酸钠抗骨质疏松的机制主要是抑制破骨细胞的活性,同时模型组大鼠骨组织的CREB表达水平较正常组下降,组间比较具有统计学意义,这间接印证了cAMP反应元件具有成骨细胞活性,这与有关研究结果[54-62]表明激活cAMP-PKA-CREB信号通路可调控BMP-2活性,BMP-2可通过促进成骨细胞分化、促进其他成骨因子的表达(如成骨细胞标志基因骨桥蛋白,Cbfa1,COL1Aα1,唾液蛋白,碱性磷酸酶,脂肪酸偶联蛋白4等的表达),从而与成骨细胞或骨髓基质细胞膜上的BMP-2受体(BMPRIα和Ⅱ)或破骨细胞表面膜受体结合,激活其下游的信号转导分子,调节其自身活动,诱导骨髓间质充质细胞分化为成骨细胞或软骨细胞,并能够抑制破骨细胞活性的报道相符。
方法:取6月龄健康SD大鼠40只,雌性,体重(240±20)g,称重后随机分组、编号,共4组:空白对照组(n=10)、模型组(n=10)、西药组(n=10)、川续断水煎液组(n=10)(20g/Kg.d)分笼喂养。首先各组大鼠经腹腔注射5%水合氯醛(用量:0.7ml/100g)达到麻醉效果后,沿下腹正中线作长2cm切口,逐层切开,暴露腹腔,找到输卵管后确认双侧卵巢,除空白对照组不作任何处理外,其余各组结扎卵巢血管后除净双侧卵巢,再依次逐层缝合至皮肤并再次消毒;术后3天所有大鼠均臀部肌肉注射青霉素5万单位,每日1次,以预防感染,正常喂养8周,经双能X线确认造模成功后,第9周起开始给药,每组根据实验设计给予不同的药物进行喂养,即空白对照组不灌胃,西药阿仑膦酸钠组在标准饲料常规喂养的同时每天灌服阿仑膦酸钠悬剂8周,川续断水煎液组继续用标准饲料喂养的同时每天灌服川续断水煎液8周,模型组给予同等剂量的生理盐水灌胃,灌胃8周后,四组大鼠于术前24小时禁食,待麻醉满意后,腹主动脉采血测大鼠血清生化指标,同时取大鼠双侧股骨头并剔除周围软组织制作股骨头组织病理学标本,并利用RT-PCR技术测骨组织中的BMP-2、CREB基因表达水平,所有实验数据采用SPSS19.0医学统计分析软件包对数据进行分析和处理。
结果:(1)去势造模组(去势模型组、去势西药组、去势川续断水煎液组)大鼠双侧股骨骨密度明显低于正常组,具有显著性差异(P<0.05),显示去卵巢8周后去势骨质疏松大鼠模型造模成功;(2)血清生化检测指标显示,与正常组相比模型组中与破骨细胞活性相关的指标抗酒石酸酸性磷酸酶水平升高,而与成骨细胞活性相关的指标血清碱性磷酸酶水平降低,#&P、*#P均<0.05;差异具有统计学意义;川续断组与模型组相比,**P、&&P均<0.05,川续断组与西药组相比,**P、&&P均>0.05,无统计学意义;(3)骨组织病理切片染色发现,正常组骨小梁分布规则,细胞分布均匀,空骨陷窝较少见,骨陷窝内细胞均匀分布;模型组细胞结构紊乱,骨小梁稀疏、断裂、变细,骨陷窝空虚扩大;川续断水煎液组骨组织形态学较模型组发生明显改变,单位面积内骨小梁的体积增加、增宽,排列明显变规则,空骨陷窝较少;西药组变化大致与中药组接近;(4)采用RT-PCR检测BMP-2、CREB的基因表达情况,经组间多重比较发现:BMP-2基因表达川续断组与西药组相比P=0.065(P>0.05),组间无统计学意义;川续断组与模型组相比P=0.02(P<0.05),具有统计学意义,说明川续断能够提高骨质疏松大鼠骨组织中BMP-2的表达水平,具有明显的抗骨质疏松作用;川续断组与正常组相比P=0.032(P<0.05),差异具有统计学意义;模型组与正常组相比P=0.38919(P>0.05),差异无统计学意义;西药组与正常组相比P=0.536(P>0.05)。CREB基因表达正常组与模型组相比P=0.364(P>0.05),差异无统计学意义;川续断组与正常组相比P=0.029(P<0.05);川续断组与模型组相比P=0.007(P<0.05);川续断组与西药组相比P=0.019(P<0.05),差异具有统计学意义;这说明川续断可增强CREB(cAMP反应元件)的转录活性,从而促进成骨细胞的分化以及其他成骨因子的表达,进而干预骨质疏松症的发生。
结论:(1)两种治疗药物均能提高大鼠骨组织中的BMP-2表达水平,且两组药物组间比较差异不明显,无统计学意义;这说明川续断可通过BMP-2信号通路调控骨代谢动态平衡,通过提高骨组织中的BMP-2表达,达到其诱导成骨分化的目的,从而发挥其抗骨质疏松的作用。(2)川续断能提高大鼠骨组织中的CREB水平,而西药阿伦磷酸钠确表现不明显,而阿伦磷酸钠抗骨质疏松的机制主要是抑制破骨细胞的活性,同时模型组大鼠骨组织的CREB表达水平较正常组下降,组间比较具有统计学意义,这间接印证了cAMP反应元件具有成骨细胞活性,这与有关研究结果[54-62]表明激活cAMP-PKA-CREB信号通路可调控BMP-2活性,BMP-2可通过促进成骨细胞分化、促进其他成骨因子的表达(如成骨细胞标志基因骨桥蛋白,Cbfa1,COL1Aα1,唾液蛋白,碱性磷酸酶,脂肪酸偶联蛋白4等的表达),从而与成骨细胞或骨髓基质细胞膜上的BMP-2受体(BMPRIα和Ⅱ)或破骨细胞表面膜受体结合,激活其下游的信号转导分子,调节其自身活动,诱导骨髓间质充质细胞分化为成骨细胞或软骨细胞,并能够抑制破骨细胞活性的报道相符。