【摘 要】
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研究目的:基于Wnt/β-catenin信号通路探讨复方补肾活血颗粒对骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖和成骨分化的干预作用及其调控机制,为复方补肾活血颗粒的临床应用提供实验依据。研究方法:1、制备空白血清和复方补肾活血颗粒含药血清,用不同浓度（2%、5%、8%）空白血清和含药血清对BMSCs进行体外培养,用CCK-8检测其增殖情况。2、用空白血清、不同浓度复方补肾活血颗粒含药血清及成骨分化诱导液
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研究目的:基于Wnt/β-catenin信号通路探讨复方补肾活血颗粒对骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖和成骨分化的干预作用及其调控机制,为复方补肾活血颗粒的临床应用提供实验依据。研究方法:1、制备空白血清和复方补肾活血颗粒含药血清,用不同浓度（2%、5%、8%）空白血清和含药血清对BMSCs进行体外培养,用CCK-8检测其增殖情况。2、用空白血清、不同浓度复方补肾活血颗粒含药血清及成骨分化诱导液对BMSCs进行诱导培养,分别于培养后第3天、第5天、第7天用ALP试剂盒检测各组ALP活性。3、各组细胞培养7天、21天后,分别采用碱性磷酸酶染色、茜素红染色观察各组蓝紫色沉淀及钙化结节。4、BMSCs培养21天后,Western blot检测复方补肾活血颗粒含药血清对成骨分化相关蛋白（ALP、OCN、Collagen-1、Runx2）表达的影响以及RT-PCR检测Wnt/β-catenin信号通路中Wnt3a、β-catenin、LRP5、Runx2和Osterix相关因子m RNA的表达。研究结果:1、CCK-8结果显示:含药血清干预后促进BMSCs增殖,与对照组相比,5%含药血清作用最为明显;在作用时间上,加入含药血清培养36小时后促进增殖效果最为显著,呈时间和剂量依赖性。2、在药物干预后的第3天、第5天、第7天、连续检测细胞ALP活性。结果显示:ALP活性干预后前5天明显升高,到第7天时ALP活性升高不明显甚至开始出现下降趋势。含药血清组和成骨诱导组与空白血清组相比,ALP活性明显升高,含药血清组中5%浓度ALP活性最高。3、镜下观察发现:药物干预7天后,ALP染色后可见每组细胞均呈现深蓝色至蓝紫色阳性染色区,且均高于空白血清组;干预21天后,每组均可见橘红色钙化结节形成,也均高于空白血清组。4、WB结果显示:药物干预21天后,与空白血清组比较,含药血清低、中、高剂量组BMSCs中ALP、OCN、Collagen-1、Runx2蛋白表达水平升高,且以中浓度表达水平最高,成骨诱导组蛋白表达水平高于空白血清组及含药血清组,差异具有统计学意义。5、RT-PCR结果显示:药物干预21天后,与空白组相比,含药血清组中Wnt3a、β-catenin、LRP5、Runx2、Osterix m RNA表达水平明显升高,随着含药血清浓度增加,表达量也逐渐增加,尤其5%浓度时,表达量最为显著,成骨诱导组m RNA表达水平高于空白组及含药血清组,差异具有统计学意义。结论:复方补肾活血颗粒含药血清可以促进BMSCs增殖,上调Wnt/β-catenin信号通路中Wnt3a、β-catenin、LRP5、Runx2、Osterix m RNA的表达,并通过促进成骨相关蛋白ALP、OCN、Collagen-1、Runx2的表达,从而提高BMSCs成骨分化能力。
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