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1.目的(1)通过金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)生物被膜(Biofilm,BF)的微生物实验,给予复方黄柏液涂剂干预,观察复方黄柏液涂剂对SA及其生物被膜的抑制作用。(2)建立SA生物被膜感染创面的大鼠模型,给予复方黄柏液涂剂干预,观察其对生物被膜感染创面控制、肉芽生长和创面愈合的影响。2.方法2.1复方黄柏液涂剂对金葡菌生物被膜抑制作用的体外实验通过建立体外SA生物被膜模型,给予不同浓度复方黄柏液涂剂干预,通过最低抑菌浓度测定、细菌菌落计数(Colony-Forming Units,CFU)实验、96孔板实验以及扫描电子显微镜来评估复方黄柏液涂剂对SA生物被膜的抑制和破坏作用。2.2复方黄柏液涂剂对SA生物被膜形成感染创面后的体内实验建立SA生物被膜感染大鼠的动物模型,皮下植入导管并接种细菌,形成生物被膜感染性创面,分别观察正常组、模型组、中药组、抗生素组大鼠的体重以及创面愈合情况,并将创面组织进行HE染色后通过显微镜下观察创面组织病理改变以及酶联免疫分析法检测IL-1、IL-6、TNF-α、VEGF-A、EGF以及TGF-β等相关指标变化。3.结果3.1复方黄柏液涂剂对金葡菌生物被膜抑制作用的体外实验(1)最低抑菌浓度实验表明,金黄色葡萄球菌(NCTC8325)对复方黄柏液涂剂敏感,MIC为140μL/m L。(2)CFU实验结果表明,不同浓度的复方黄柏液涂剂对金黄色葡萄球菌(NCTC8325)抑制作用不同,在药物浓度达到70μL/m L后抑菌效果较之前的药物浓度有差异,且差异有统计学意义(P<0.05)。(3)96孔板结晶紫染色和酶标仪检测实验结果表明,在复方黄柏液涂剂药物浓度达到70μL/m L时,对NCTC8325生物被膜的形成均有明显抑制作用,且不同浓度的复方黄柏液涂剂对其抑制作用有差异,且差异有统计学意义(P<0.05)。(4)扫描电子显微镜观察复方黄柏液涂剂对NCTC8325形成生物被膜的影响,结果提示:在复方黄柏液涂剂浓度达到70μL/m L以后,视野下的细菌生物被膜明显减少,在药物浓度达到140μL/m L之后,视野中仅可见极少的以微菌落形式存在的细菌。3.2复方黄柏液涂剂对金葡菌生物被膜形成感染创面后的干预研究(1)通过对大鼠体内放置的导管进行染色和扫描电子显微镜下观察,证实了大鼠体内存在生物膜被膜感染,即造模实验成功。(2)造模成功后,受创面感染影响,各组大鼠体重均呈下降趋势。在开始药物干预后,各组大鼠体重逐渐呈上升趋势。在造模后第7天,模型组大鼠体重与空白组、中药组有显著差异(P<0.05);在造模后第11天,模型组大鼠受创面持续感染的影响,体重增长缓慢,低于空白组、中药组以及抗生素组水平,且有统计学意义(P<0.05)。在造模后第14天,模型组大鼠体重仍显著低于同时期的中药组和抗生素组水平(P<0.05)。(3)HE染色结果:药物干预后的第3天,接种细菌的模型组、中药组和抗生素组仍有不同程度的炎细胞浸润,创面内见肉芽组织及少量胶原纤维;空白组可见较正常表皮肥厚的新生表皮,创面内见肉芽组织及少量胶原纤维;药物干预后的第7天,模型组可见大量的炎细胞浸润,肉芽形成;中药组和抗生素组炎细胞浸润程度较模型组减轻,可见表皮增生,有新生上皮组织出现;但抗生素组炎症浸润情况较中药组明显;空白组有表皮增生,创面表面附有一层炎细胞和炎性渗出物,新生上皮形成;药物干预后14天,模型组新生表皮比正常表皮肥厚,仍可见炎细胞。中药组和抗生素组新生表皮均比正常表皮肥厚,仍可见少量炎细胞。正常组的上皮组织大范围形成,表皮细胞分化正常。(4)炎症指标和生长指标检测结果:炎症指标IL-1、IL-6、TNF-α指标在各组动物实验过程中均呈现下降趋势,以中药组下降最为明显,模型组下降最为不明显。在药物干预后的第3天,中药组与空白组的IL-1水平有显著差异(P<0.05);在药物干预后的第7天,模型组与抗生素组的IL-1、IL-6、TNF-α水平与空白组有显著差异(P<0.05);在药物干预后的第14天,空白组与模型组、模型组与中药组、中药组与抗生素组的IL-1、IL-6、TNF-α水平均有显著差异(P<0.05)。生长和愈合指标EGF、VEGF-A、TGF-β指标在各组动物实验过程中均呈现上升趋势,以中药组上升最为明显,模型组上升最为不明显。在药物干预后的第3天,模型组与中药组的EGF、TGF-β水平与空白组有显著差异(P<0.05);在药物干预后的第7天,模型组与中药组的EGF、VEGF-A、TGF-β水平有显著差异(P<0.05);在药物干预后的第14天,中药组与模型组、中药组与抗生素组的EGF、VEGF-A、TGF-β水平均有显著差异(P<0.05)。4.结论(1)在一定药物浓度下,复方黄柏涂剂对金黄色葡萄球菌及其生物被膜形成有较好的抑制作用,且随着药物浓度增加,抑制作用增强。(2)复方黄柏涂剂对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的创面,不仅具有较好的感染和炎症抑制作用;而且具有促进创面愈合作用。