中医药治疗肺癌的用药规律挖掘及芪玉三龙方对肺癌A549细胞相关基因表达的影响

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目的收集整理名老中医治疗肺癌的医案,总结患者的证素分布特点,探索名老中医治疗肺癌的药物配伍规律。通过对核心组方进行核心靶点和功能通路的筛选,挖掘中医药治疗肺癌的潜在治疗靶点。通过细胞实验验证芪玉三龙方含药血清通过上述核心靶点影响肺癌A549细胞,继而为芪玉三龙方后续的抗肺癌机制提供理论依据。方法1.从知网、维普、万方数据库中检索有关名老中医治疗肺癌的文献,筛选出符合纳入标准的医案,并对医案中的证素与中药进行规范化处理,将相关信息导入excel,建立治疗肺癌的医案数据库。运用SPSS Modeler 18.0、SPSS 22.0软件进行数据挖掘分析,对性别、年龄、病理分型、证素、中药进行频数分析,对高频中药进行关联规则、系统聚类和k均值聚类分析,总结肺癌患者的一般情况及证素分布特点,归纳中药的使用、配伍规律及核心组方。2.选取核心组方3(黄芪、茯苓、蛇舌草、半枝莲、薏苡仁)进行网络药理学分析,以“黄芪”、“茯苓”、“蛇舌草”、“半枝莲”、“薏苡仁”为关键词,通过中药数据库检索得到有效活性成份及其作用靶点。基于TCGA肿瘤数据库,使用R语言平台对非小细胞肺癌的转录组数据进行分析,获得疾病相关的靶点基因。通过对药物活性成分靶点与疾病靶点的交集分析,筛选出核心组方针对非小细胞肺癌的潜在有效靶点。对上述靶点进行蛋白质互作网络分析、功能富集分析,预测核心组方作用于非小细胞肺癌的靶点、生物过程和信号通路等机制。3.选取40只SD雄性大鼠,随机为空白血清组和芪玉三龙方组,分别予生理盐水和芪玉三龙方灌胃,制备空白血清和芪玉三龙方含药血清。选取非小细胞肺癌细胞株A549细胞,鉴于前期课题组筛选出的芪玉三龙方含药血清的作用浓度与作用时间,组别为CON组(空白组)、KB组(空白血清组)、QYSL组(芪玉三龙方组)。使用PCR和WB实验检测c-JUN、PPAR-γ、COX-2、MMP-9的m RNA和蛋白质表达量,探讨QYSL含药血清能否通过影响上述靶基因,进而调控A549细胞进程。结果1.共纳入医案226例,中药处方226个。在性别分布上,男性147例(65.04%),女性79例(34.96%),男女比例1.86:1;年龄分布上,最大年龄为86岁,最小年龄为35岁,51岁~80岁共180例(79.65%),为高发病人群。病理分型分布上,腺癌138例(61.06%),鳞癌66例(29.21%),腺鳞癌5例(2.21%),小细胞肺癌17例(7.52%)。非小细胞肺癌与小细胞肺癌比例12.29:1,非小细胞肺癌发病率92.48%。2.统计证素的分布,其中病位证素主要为肺、脾、肾,肺与脾占比83.20%。病性证素主要为气虚、痰、阴虚、癌毒、血瘀、热。统计中药频次,得到高频中药43种,其中以补虚药、清热药和化痰止咳药为主,占比74.42%。高频药物的药性以寒、凉为主,药味主要是苦、甘。3.二项关联规则中的药物以补虚药为主,功效为健脾,补气,养阴。三项关联规则的药物以清热药与补虚药及具有健脾化痰的药物之间相互组合。4.系统聚类得到7个组合,C1白术、茯苓、党参、半夏、陈皮;C2薏苡仁、黄芩;C3鸡内金、石见穿、苦杏仁、黄芪、麦芽;C4北沙参、仙鹤草、麦冬、太子参;C5蛇舌草、半枝莲、桑白皮、鱼腥草;C6浙贝母、金荞麦;C7甘草、桔梗、生地。k均值聚类,生成4个核心组方,核心组方1白术、黄芪、茯苓、党参、鸡内金;核心组方2白术、茯苓、半夏;核心组方3黄芪、茯苓、蛇舌草、半枝莲、薏苡仁;核心组方4黄芪、蛇舌草、麦冬、薏苡仁、太子参、北沙参、仙鹤草。后续选取核心组方3进行网络药理学分析。5.对核心组方3进行网络药理学分析,获得有效药物靶点438个。对非小细胞肺癌的肿瘤转录组数据分析进行生物信息学分析,获得显著差异表达基因4908个。两者取交集,获得核心组方3治疗肺癌的潜在有效靶点127个。对上述靶点进行蛋白互作网络分析(PPI),得到核心靶点基因19个,排名前7的分别为IL1β、JUN、ESR1、MMP-9、FOS、PPARG(编码蛋白质PPAR-γ)、PTGS2(编码蛋白质COX-2)。进行基因富集分析,主要的生物学过程为对药物反应、转录的正调控、氧化还原过程、炎症反应、凋亡过程。主要的功能通路为细胞周期、PI3K-Akt信号通路、NF-κB信号通路。6.CCK8结果显示,芪玉三龙方含药血清作用浓度为20%,作用时间为24h,对于A549细胞的抑制作用效果最明显(P<0.01)。PCR和WB结果显示芪玉三龙方含药血清能够促进PPAR-γ的表达(P<0.01),抑制c-JUN、COX-2、MMP-9的表达量(P<0.01)。结论1.本研究总结肺癌的医案,其中以男性为主,50岁以上的年龄为高发人群,常见病理分型为肺腺癌。证素频数结果显示,病位在肺、脾、肾,病性多虚实夹杂,其中以气虚、阴虚为主,兼有痰、癌毒、血瘀等实性病理因素。中药关联规则及聚类结果显示,常见用药配伍由清热药、补虚药及具有健脾化痰药物的相互组合,该结果为肺癌患者的中医诊疗与用药提供参考。2.本研究分析核心组方(黄芪、茯苓、蛇舌草、半枝莲、薏苡仁)治疗非小细胞肺癌潜在的有效靶点。对靶点的基因富集分析表明该核心组方主要涉及炎症及肿瘤细胞进程相关的功能通路过程,其治疗肺癌的潜在机制与炎症反应及细胞周期过程具有密切联系。3.芪玉三龙方含药血清可通过增加肺癌A549细胞PPAR-γ的m RNA及蛋白的表达,降低c-JUN、COX-2、MMP-9的m RNA及蛋白的表达,进而抑制肺癌细胞的增殖。
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