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目的:探索全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)对Hepa1-6肝肿瘤细胞分化及细胞自噬水平的影响,探讨自噬在ATRA调控Hepa1-6细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及分化中的作用及可能的机制,为ATRA用于肝癌的临床治疗提供重要的实验依据。方法:1以Hepa1-6细胞为研究对象,首先分别给予0.1、1、10μmol/L浓度的ATRA处理,荧光定量PCR(real-time PCR)检测肝细胞相关标志基因白蛋白(albumin,ALB)和细胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK18),酪氨酸转氨酶(tyrosine aminotransferase,TAT),载脂蛋白B(Apolipoprotein B,ApoB)和甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)基因水平的表达;Western blot检测ALB、CK18和AFP蛋白水平的表达。吲哚菁绿(Indocyanine green,ICG)及过碘酸-希夫(Periodic acid-Schiff,PAS)染色检测Hepa1-6细胞的成熟功能,透射电镜观察细胞间连接及自噬小体,综合以上结果筛选出对Hepa1-6细胞成熟分化作用较强的ATRA浓度10μmol/L。Western blot检测自噬相关标志蛋白LC3,Beclin1,RAB7和P62的表达,ptfLC3(dual-fluorescene mRFP-GFP-LC3plasmid)转染细胞后共聚焦观察自噬流变化,检测自噬流是否通畅。21)给予自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)和巴弗洛霉素(Bafilomycin,Baf)预处理3 h后,再给予10μmol/L浓度的ATRA处理,PAS染色筛选3-MA和Baf的最佳作用浓度。透射电镜检测细胞内自噬小体,共聚焦检测自噬流,real-time PCR检测自噬标志基因LC3和BECN1的表达,Western blot检测自噬标志蛋白LC3,Beclin1蛋白的表达,验证自噬抑制剂能否有效抑制ATRA诱导的自噬水平。2)ATRA诱导并抑制自噬水平后,台盼蓝拒染实验计数细胞,克隆形成实验检测对Hepa1-6细胞增殖的影响,流式细胞术和Hoechst染色检测细胞凋亡,伤痕愈合实验和Transwell实验检测细胞的迁移与侵袭能力,real-time PCR及免疫荧光染色检测肝细胞成熟标志蛋白的表达,ICG摄取、PAS染色检测细胞的代谢合成功能,探讨自噬在ATRA调控Hepa1-6细胞恶性生物学行为中的作用。3)自噬抑制后real-time PCR及Western blot检测神经型钙粘蛋白(nerve cadherin,N-cadherin)、锌指蛋白转录因子Snail、波形蛋白Vimentin和扭曲蛋白Twist等间质转化相关蛋白,及上皮标志蛋白上皮细胞钙粘蛋白(epithelia cadherin,E-cadherin)的mRNA水平及蛋白水平的表达,探讨自噬与Hepa1-6细胞上皮间质转化的关系,进一步探索自噬影响ATRA调控Hepa1-6细胞恶性生物学行为的可能机制。同时,Western blot检测ATRA作用前后自噬信号通路相关调控蛋白p-PI3K(包括p85和p110),p-Akt,mTOR,p-mTOR,Bcl-2,p-Bcl-2,JNK及p-JNK的蛋白表达水平,免疫荧光检测Bcl-2和p-Bcl-2的表达,探讨ATRA调控Hepa1-6细胞自噬水平的可能分子机制。结果:1与空白对照组相比,ATRA可呈浓度依赖性抑制Hepa1-6细胞中肝肿瘤标志蛋白AFP的表达,并促进肝细胞成熟标志ALB、CK18、TAT和ApoB的表达,ICG及PAS染色提示阳性细胞数明显增多;随着ATRA作用浓度增高,透射电镜观察到细胞间连接和细胞骨架明显增多,细胞内自噬小体的数量也明显增多,10μmol/L的处理组还发现了具有分泌蛋白功能的高尔基复合体。综上我们选择10μmol/L ATRA作为最佳的作用浓度。Western blot结果显示ATRA作用后自噬相关标志蛋白LC3,Beclin1,RAB7的表达明显增高,P62的表达稍有增强,激光共聚焦可见细胞胞浆内代表自噬小体的绿色亮点及代表自噬溶酶体的红色亮点较对照组均呈明显增多。2 1)PAS染色结果显示,3-MA和Baf作用后细胞内阳性细胞数较ATRA明显减少,综合考虑其对细胞功能及状态的影响,分别选择4 mmol/L和50 nmol/L作为3-MA和Baf的最适作用浓度。透射电镜下发现3-MA+ATRA组细胞内自噬小体较ATRA组减少,而Baf+ATRA组细胞内自噬小体明显堆积;同样,激光共聚焦检测发现3-MA+ATRA组代表自噬小体的绿色亮点明显减少,Baf+ATRA组的绿色亮点堆积而代表自噬溶酶体的红色亮点减少;3-MA+ATRA组自噬相关标志蛋白LC3、Beclin1、P62的蛋白水平表达降低,自噬相关基因BECN1 mRNA表达下调,LC3的mRNA表达无明显变化,Baf+ATRA组自噬相关标志蛋白LC3、P62明显堆积,Beclin1蛋白表达降低,自噬相关基因BECN1 mRNA表达降低,LC3的mRNA表达无明显变化,提示3-MA和Baf可有效抑制ATRA诱导Hepa1-6细胞的自噬。2)细胞计数实验发现ATRA可有效抑制Hepa1-6细胞的增殖能力,自噬抑制后细胞的增殖速度较ATRA组加快,克隆形成实验结果显示ATRA组克隆形成率明显减少,自噬抑制后克隆性成数有增多,但各组之间无统计学差异;流式细胞术和Hoechst实验结果均显示ATRA组细胞凋亡率较对照组显著增高,自噬抑制后细胞凋亡率较ATRA组明显减少;伤痕愈合实验结果显示ATRA组细胞伤痕愈合较对照组明显减慢,自噬抑制后愈合较ATRA组明显增快;Transwell迁移与侵袭实验结果显示ATRA组细胞迁移与侵袭率较对照组明显减少,而自噬抑制后细胞的迁移与侵袭率反而增高。与ATRA诱导组比较,ICG摄取实验及PAS染色结果显示自噬抑制后细胞内ICG摄取及PAS染色的阳性细胞数明显减少,成熟肝细胞标志物ALB和CK18 mRNA水平及蛋白水平的表达均降低,而肝肿瘤标志物AFP的表达反而增高。3)Real-time PCR和Western blot结果提示与对照组相比,ATRA组的Snail、Vimentin、Twist、N-cadherin等间质标志物的表达水平较低,而自噬抑制后表达水平升高。而ATRA处理后,CK18等上皮标志物表达上调,自噬抑制剂处理后下调。ATRA处理后E-cadherin表达增加,但ATRA、3-MA+ATRA、Baf+ATRA组间差异无统计学意义。此外,Western blot结果也显示,ATRA作用于Hepa1-6细胞后,p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白水平的表达没有明显变化,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达明显降低,p-Bcl-2,JNK和p-JNK的表达均增高,免疫荧光结果显示Bcl-2定位在胞浆,其活性形式p-Bcl-2定位在胞核,ATRA作用后Bcl-2的表达降低,p-Bcl-2表达增高,以核内表达增强为主。结论:1 ATRA呈浓度依赖性诱导Hepa1-6细胞的成熟分化并促进细胞自噬水平。2自噬可能通过逆转上皮间质转化参与调控ATRA对Hepa1-6细胞恶性生物学行为的抑制作用。ATRA诱导自噬可能通过JNK/Bcl-2激活Beclin1途径,而非PI3K/Akt/mTOR信号通路。