论文部分内容阅读
研究背景探究中晚期胃癌进展的新靶点及治疗策略仍是临床亟待解决的问题。桥粒胶糖蛋白2（DSC2）是桥粒连接的重要组成,也是唯一在胃组织表达的DSCs亚型。已发现Ⅲ/Ⅳ期胃癌组织中DSC2基因水平明显低于Ⅰ/Ⅱ期,该基因是否与胃癌进展有关,其作用和潜在机制尚不明确。本课题拟研究DSC2抑制胃癌生长转移的机制,并探究其上游调控因子,为临床提供新的胃癌治疗靶点及思路。有报道改良低分子柑橘果胶（MCP）可通过激活超氧化物歧化酶（SOD）上调颈动脉内皮细胞的DSC2表达,而活性氧（ROS）可下调DSC2的表达。ROS可促进多种肿瘤的发生发展,且在SODs的3个亚型中,SOD3是比较明确的肿瘤抑制因子。故我们预测MCP可能通过激活SOD3上调胃癌细胞DSC2的表达。奥沙利铂是治疗胃癌的一线化疗药物,但常因疾病进展疗效不佳更换治疗方案。此外,奥沙利铂通过产生ROS诱导周围神经病变（CIPN）也是终止治疗的重要原因。CIPN多呈剂量限制性,通过联合用药提高奥沙利铂疗效减少其给药剂量或联合对抗ROS的化合物均可缓解CIPN症状。基于对DSC2抑制中晚期胃癌进展及MCP激活SOD3上调DSC2表达的研究,我们推测MCP联合奥沙利铂可增强奥沙利铂的胃癌细胞杀伤作用,抑制侵袭和迁移,并通过对抗ROS缓解奥沙利铂诱导的CIPN症状,为中晚期胃癌患者提供有潜力的临床治疗策略。第一部分DSC2抑制胃癌生长转移的作用及机制研究研究目的探究DSC2抑制胃癌生长转移的作用和相关机制。研究方法1)挖掘癌症基因组图谱（TCGA）数据库相关信息。收集人胃癌、胃组织标本,选用人正常胃粘膜、胃癌细胞,采用qRT-PCR实验、Western blot实验等验证DSC2的表达水平。2)通过转染慢病毒/siRNA,上调/敲减胃癌细胞DSC2表达。采用MTT实验、transwell实验等,研究DSC2对胃癌细胞生存、侵袭和迁移的影响。3)通过挖掘BioGRID数据库信息和液相色谱-串联质谱法,预测DSC2调节胃癌细胞生长转移的关键靶点。采用免疫共沉淀（Co-IP）实验,验证DSC2对这些靶点的调控作用。4)构建BALB/c裸鼠胃癌荷瘤模型和转移模型,体内实验研究DSC2对胃癌生长转移的影响。5)引入BRD4、β-catenin转录抑制剂JQ1、ICG-001,PI3K特异性抑制剂和激活剂LY294002和IGF1,验证DSC2对关键靶点和信号通路的调控作用。实验结果1)DSC2在胃癌组织和胃癌细胞中表达均显著下调,且与pTNM分期呈负相关。2)DSC2可显著抑制胃癌细胞的生存、侵袭和迁移,并可抑制裸鼠荷瘤的生长和肺转移。3)过表达DSC2的胃癌细胞中γ-catenin核表达减低,DSC2/γ-catenin复合物、P53和PTEN表达上调,BCL-2表达下调,PI3K和AKT磷酸化水平受抑制。4)IGF1可逆转DSC2过表达对胃癌细胞生存的抑制作用,而LY294002可增强DSC2对生存的抑制作用。同时IGF1和LY294002均不影响胃癌细胞DSC2的表达。5)过表达DSC2抑制BRD4和β-catenin的核转移,并下调Snail、N-cadherin、CD44和MMP9的表达水平。6)JQ1和ICG-001均可抑制低表达DSC2胃癌细胞的迁移和侵袭,但并不能进一步抑制过表达DSC2胃癌细胞的迁移和侵袭。小结DSC2在胃癌组织和细胞中表达明显减低。DSC2一方面通过抑制γ-catenin的核转位和转录活性调控P53/PTEN/PI3K/AKT信号通路,进而抑制胃癌的生长。另一方面主要通过抑制BRD4/Snail信号通路和β-catenin的转录活性,下调Snail、N-cadherin、CD44和MMP9表达,抑制胃癌上皮间质转化（EMT）而抑制胃癌的迁移和侵袭。第二部分MCP通过激活SOD3上调胃癌细胞DSC2表达的作用及机制研究研究目的研究MCP上调胃癌细胞DSC2表达的作用及相关机制。研究方法1)NBT实验和qRT-PCR实验观察MCP对胃癌细胞和培养基SOD活性的调控及SOD1,SOD2,SOD3mRNA表达水平的影响。2)转染siRNA分别下调SOD1,SOD2和SOD3表达后,采用qRT-PCR实验和Western blot实验观察胃癌细胞DSC2的表达水平。3)Western blot 实验研究 MCP 对胃癌细胞 SOD3,EGFR,PKP3 和 DSC2表达水平的影响。4)引入SOD抑制剂DETC、EGFR磷酸化抑制剂AG1478,验证MCP对关键靶点的调控作用。实验结果1)MCP提高细胞和培养基的SOD活性,上调SOD3 mRNA表达水平,并不影响SOD1和SOD2的表达。2)SOD3可上调胃癌细胞DSC2表达水平,SOD1和SOD2并不能调控DSC2的表达。3)MCP可上调胃癌细胞SOD3表达水平;过表达SOD3和MCP均可上调PKP3和DSC2的表达,并抑制EGFR磷酸化;DETC可逆转MCP诱导的DSC2和PKP3表达水平上调,以及对EGFR磷酸化的抑制;AG1478可上调PKP3和DSC2表达,但对SOD3的表达水平无显著影响。小结MCP通过激活SOD3/EGFR/PKP3信号通路上调胃癌细胞DSC2表达。第三部分MCP通过上调SOD3/DSC2对奥沙利铂治疗胃癌增效减毒的作用及机制研究研究目的评价MCP与奥沙利铂联用对胃癌细胞的体内外杀伤作用、对奥沙利铂诱导CIPN症状的缓解作用,MCP通过上调DSC2而抑制胃癌细胞迁移和侵袭的作用及相关机制。研究方法1)奥沙利铂和/或MCP预处理高表达DSC2的胃癌细胞后,采用MTT实验等观察DSC2、奥沙利铂和/或MCP对细胞生存能力的影响。2)DCFH-DA探针实验、构建裸鼠移植瘤模型,观察不同剂量奥沙利铂和/或MCP对胃癌细胞ROS水平的影响,以及胃癌移植瘤生长的抑制作用。采用冯·弗雷实验、热痛感受实验、冷凝板实验评估裸鼠CIPN症状。3)采用MTT实验、transwell实验等观察MCP以及过表达SOD3后对低表达DSC2胃癌细胞生存、侵袭和迁移的影响。4)引入DETC、AG1478后,观察SOD3和EGFR对低表达DSC2胃癌细胞生存、侵袭和迁移的调控作用。实验结果1)联用MCP时,奥沙利铂对胃癌细胞的IC50值明显低于单药组。过表达DSC2可增强奥沙利铂对胃癌细胞的杀伤作用,但对联用组胃癌细胞的杀伤作用无明显增强。MCP可增强奥沙利铂对裸鼠移植瘤生长的抑制作用。2)MCP可降低奥沙利铂所致胃癌细胞ROS水平的升高。与15 mg/kg奥沙利铂组相比,30 mg/kg组诱导的裸鼠CIPN症状更加显著。与15 mg/kg单药组相比,联合MCP后可明显缓解CIPN症状。3)MCP及过表达SOD3均可抑制胃癌细胞的生存、迁移和侵袭。DETC可逆转MCP对胃癌细胞生存、侵袭和迁移的抑制作用。敲减DSC2表达可逆转SOD3过表达对胃癌细胞生存、迁移和侵袭的抑制作用。AG1478可抑制低表达DSC2胃癌细胞的生存、迁移和侵袭。小结MCP通过激活胃癌细胞SOD3/EGFR/PKP3/DSC2信号通路抑制其迁移和侵袭、显著增效奥沙利铂对胃癌细胞的体内外杀伤作用,并通过上调SOD3、降低ROS水平来缓解奥沙利铂所致CIPN症状。研究结论1)DSC2在胃癌组织和细胞中表达明显减低。上调DSC2表达一方面通过抑制γ-catenin的核转位及其转录活性抑制胃癌的生长;另一方面通过抑制BRD4/Snail信号通路和β-catenin的转录活性,抑制EMT从而抑制胃癌的迁移和侵袭。2)MCP通过激活SOD3/EGFR/PKP3信号通路上调胃癌细胞DSC2表达。3)MCP通过上调DSC2表达抑制胃癌细胞的迁移和侵袭、显著增强奥沙利铂对胃癌细胞的体内外杀伤作用,并通过上调SOD3缓解奥沙利铂所致CIPN症状。