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近年来,随着小鼠品系的不断增多以及适用于不同研究需要的转基因小鼠的大量出现,使得传统的保种方式已不能满足人们的需要,精子冻存作为动物种质资源保存的一种有效手段开始被广泛应用于实验动物中,该方法具有方便快捷、成本低廉的优势而倍受研究者们的青睐,与此同时也面临着一些问题:如冷冻精子复苏后存在体外受精率不稳定、胚胎发育阻滞、产生子代的成功率低下等情况。所以本文对影响小鼠冷冻精子体外受精的相关因素进行研究,初步探讨各因素对冷冻精子体外受精的影响机理,以期建立冻冷冻精子体外受精的最佳体系。本研究采用Nakagata精子冷冻保存方法进行小鼠精子的冷冻保存,复苏后以TYH为获能液、HTF为受精液、HTF/KSOM为早期胚胎培养液,利用控制变量的原则进行不同密度、不同获能时间、受精液中添加还原性谷胱甘肽与否、不同品系背景、不同周龄、不同基因型的小鼠冷冻精子体外受精实验,并对其早期胚胎发育结果(受精率、卵裂率、优质4-细胞胚胎率、囊胚率)进行差异显著性比较分析,从而评价其体外受精效果。结果可见:小鼠冷冻精子密度不同,体外受精及早期胚胎发育情况差异显著,密度过低,体外受精早期胚胎发育效果极差,密度过高,受精率虽然下降幅度不大,但卵裂率较低,密度在0.8-2.0×10~6个/mL范围内可以获得较好的体外受精效果;不同获能时间的冷冻精子体外受精数据显示获能时间不同,体外受精效果不同,获能时间过短(5 min)或过长(90 min)受精率、卵裂率、优质4-细胞胚胎率、囊胚率均最差,获能时间为20-40 min时,体外受精效率最高;受精液中添加还原性谷胱甘肽可显著提高冷冻精子的体外受精率及卵裂率,对优质4-细胞胚胎率及囊胚率影响不大;8个不同品系背景的小鼠冷冻精子体外受精早期胚胎发育情况差异显著,不同品系的小鼠精子低温生物学特性各异,杂交系和封闭群的小鼠冷冻精子体外受精效果要明显好于近交系,将其中5个品系的冷冻精子与同品系的新鲜精子进行横向比较,发现冷冻精子体外受精效率较新鲜精子均有明显下降且下降程度不成比例;不同周龄的小鼠冷冻精子体外受精结果差异亦显著,周龄过小(8周龄以下)不宜进行精子冻存及体外受精,周龄过大(30-34周)囊胚率下降幅度较大,12-30周龄小鼠冷冻精子体外受精及早期胚胎发育效果较好,其中12-24周龄最好;相同遗传背景不同基因型的小鼠冷冻精子体外受精率、卵裂率、优质4-细胞胚胎率及囊胚率也存在显著差异。综上,小鼠冷冻精子体外受精及早期胚胎发生受精子密度、获能时间、受精液中是否添加还原性谷胱甘肽、品系背景、周龄,基因型等因素的影响,在该冻存复苏培养体系下小鼠冷冻精子体外受精最佳密度为0.8-2.0×10~6个/mL,最适获能时间为20-40 min,受精液中添加还原性谷胱甘肽可有效提高受精效率,在进行小鼠精子冷冻保种前,要注意其品系背景、周龄及基因型,以便可控的选取适宜的冷冻方法从而达到最佳复苏效果。