论文部分内容阅读
第一部分Lnc RNA AC093818.1在胃癌组织中的表达及其与胃癌进展关系背景:胃癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,非常容易发生淋巴转移和血液转移。肿瘤的远处转移是胃癌患者主要的死亡原因,但是目前胃癌侵袭转移的分子机制仍不清楚。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)是一类长度大于200nt,不具有开放性阅读框的一类非编码RNA分子,在免疫反应、干细胞多能性及细胞的增殖凋亡分化等多种生物过程中发挥着重要作用。AC093818.1是一个天然存在于人体的lnc RNA,位于2号染色体的173420153-173421135,在高转移的胃癌患者肿瘤组织中异常高表达,可达5倍以上,但目前国内外学者对AC093818.1在胃癌侵袭转移中的作用及其相关的调控机制缺乏系统的研究。本部分实验通过检测不同分期的胃癌患者肿瘤组织中的AC093818.1的表达情况,研究AC093818.1在胃癌组织中的表达水平及其与肿瘤侵袭转移的相关性。方法:收集2016年至2017年广州医科大学附属肿瘤医院20例确诊为胃癌的患者胃癌肿瘤标本,其中伴有淋巴结转移的10例,未发现转移的10例。通过文献分析,得到5个在高转移胃癌中异常高表达的lnc RNA(AC093818.1,CTD-2541M15.1,BC047644,RP11-597M12.1,RP11-40A13.1),验证这5个lnc RNA在已发生转移和未发生转移的胃癌组织中的表达情况,并进行临床特征分析,研究lnc RNA表达情况与临床特征的关系。分析筛选出最合适本项研究的lnc RNA,研究其在发生转移和未发生转移的胃癌组织中的表达情况,并分析其与患者肿瘤大小、临床病理分期、侵润程度及淋巴结转移的关系。结果:在高转移胃癌患者肿瘤组织中异常高表达的5个lnc RNA(AC093818.1,CTD-2541M15.1,BC047644,RP11-597M12.1,RP11-40A13.1)中,AC093818.1在高转移胃癌组织中的表达显著增高(p<0.01),而其他4个lnc RNA在已转移和未转移胃癌组织中表达则无明显差异。通过临床特征分析发现,AC093818.1的表达水平与患者的临床分期、淋巴结转移、胃癌远处转移密切相关。统计分析表明,AC093818.1的表达水平与患者的临床分期、淋巴结转移、胃癌远处转移,其差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:AC093818.1在胃癌组织中的表达水平与患者的临床分期、淋巴结转移及胃癌远处转移呈正相关,可能是潜在的胃癌侵袭转移肿瘤标志物。第二部分AC093818.1通过PDK1对胃癌细胞侵袭转移的影响背景:恶性肿瘤的主要生物学特征是侵袭和转移,肿瘤的侵袭转移过程非常复杂,对患者的临床病理特征以及预后有重大影响。AC093818.1在胃癌患者肿瘤组织中的表达情况与肿瘤的大小、临床病理分期、侵润程度及淋巴结转移显著相关。3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)是一个主要调控激活AGC蛋白激酶家族的蛋白激酶,在许多信号通路都有着非常重要的作用。AC093818.1在胃癌细胞中的表达情况与PDK1的关系仍未受到验证。本研究筛选AC093818.1表达量较高的胃癌细胞株及AC093818.1表达量较低的胃癌细胞株来进行实验,观察AC093818.1的表达与PDK1的关系及其对胃癌细胞侵袭转移的影响。方法:1.细胞筛选:在BGC82、MGC803、MKN28、MKN45、SGC7901五株细胞中,筛选AC093818.1及PDK1表达相对较高及较低的细胞株。2.细胞株构建:包装AC093818.1过表达及抑制表达病毒,通过抗性筛选构建了过表达AC093818.1的MKN28-AC093818.1细胞株及空病毒对照MKN28-CTR细胞株,构建了抑制表达AC093818.1的MGC803-si AC093818.1细胞株及空病毒对照MGC803-CTR细胞株。3.transwell实验检测MKN28-CTR、MKN28-AC093818.1、MGC803-CTR和MGC803-si AC093818.1四组胃癌细胞的细胞迁移及细胞侵袭情况。4.细胞划痕实验检测MKN28-CTR、MKN28-AC093818.1、MGC803-CTR和MGC803-si AC093818.1四组胃癌细胞的细胞迁移情况。5.荧光定量PCR检测MKN28-CTR、MKN28-AC093818.1、MGC803-CTR和MGC803-si AC093818.1四组胃癌细胞中PDK1及MMP2、MMP9、E-cadherin和Vimentin的基因水平表达情况。6.western blot检测MKN28-CTR、MKN28-AC093818.1、MGC803-CTR和MGC803-si AC093818.1四组胃癌细胞中PDK1及MMP2、MMP9、E-cadherin和Vimentin的蛋白水平表达情况。结果:与MKN28-CTR组相比,MKN28-AC093818.1组胃癌细胞中PDK1因子表达上调,侵袭转移相关蛋白MMP2、MMP9和Vimentin表达亦上调,E-cadherin表达下调;MKN28-AC093818.1组胃癌细胞的侵袭能力上升,差异具有统计学意义(P<0.05);MKN28-AC093818.1组胃癌细胞的迁移能力上升,差异具有统计学意义(P<0.05)。相比于MGC803-CTR组,MGC803-si AC093818.1组胃癌细胞中PDK1表达下调,侵袭转移相关因子MMP2、MMP9和Vimentin表达下调,E-cadherin表达上调,MGC803-si AC093818.1组胃癌细胞的侵袭能力降低,差异具有统计学意义(P<0.05);MGC803-si AC093818.1组胃癌细胞的迁移能力降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:过表达AC093818.1可显著提高胃癌细胞的侵袭和迁移能力。过表达AC093818.1通过上调PDK1因子,间接调控相关侵袭转移基因表达,从而促进胃癌细胞侵袭转移。抑制AC093818.1表达可显著抑制胃癌细胞的侵袭和迁移能力。抑制AC093818.1表达通过抑制PDK1因子,间接调控相关侵袭转移基因表达,从而抑制胃癌细胞侵袭转移。第三部分抑制AC093818.1对胃癌转移瘤裸鼠模型的影响背景:国外研究有研究发现,在胃癌中,与相邻正常组织相比,肿瘤样本中的PDK1m RNA和蛋白表达较高。此外,与表达较低的PDK1表达相比,显示PDK1高表达的患者存活时间较短。因此,PDK1表达可以作为这类癌症的预后生物标志物。还有研究发现抑制PDK1可以分别通过多个通路来抑制癌症的侵袭转移,PDK1是一个潜在的癌症治疗靶点。本课题第一、二部分证实,AC093818.1在胃癌组织及胃癌细胞中的表达程度与PDK1的m RNA水平呈正相关,AC093818.1通过PDK1促进了胃癌细胞的侵袭转移。本部分实验将探讨通过构建AC093818.1抑制表达的稳定细胞株,构建胃癌转移瘤裸鼠模型,从动物层面上研究下调AC093818.1对PDK1表达水平及胃癌细胞增殖、侵袭转移基因表达的影响,及其与胃癌侵袭转移的相关性。方法:1.稳定细胞株构建:使用第二部分实验中构建的AC093818.1抑制表达病毒,构建MKN28的AC093818.1抑制表达稳定细胞株MKN28-si AC093818.1及对照细胞株MKN28-CTR。2.动物模型实验:培养足够量的MKN28-CTR、MKN28-si AC093818.1、MGC803-CTR和MGC803-si AC093818.1细胞株,将以上4组胃癌细胞注射至BALB/C裸鼠尾静脉构建转移瘤动物模型,分为MKN28-CTR动物组、MKN28-si AC093818.1动物组、MGC803-CTR动物组和MGC803-si AC093818.1动物组,肿瘤成型后取材观察。3.制备肿瘤组织切片,HE染色观察各组肿瘤组织坏死情况。4.荧光定量PCR检测MKN28-CTR动物组、MKN28-si AC093818.1动物组、MGC803-CTR动物组和MGC803-si AC093818.1动物组中PDK1、MMP2、MMP9、E-cadherin和Vimentin的基因水平表达情况。5.western blot检测MKN28-CTR动物组、MKN28-si AC093818.1动物组、MGC803-CTR动物组和MGC803-si AC093818.1动物组中PDK1、MMP2、MMP9、E-cadherin和Vimentin的蛋白水平表达情况。结果:动物实验中,与MKN28-CTR动物组转移瘤裸鼠相比,MKN28-si AC093818.1肿瘤发生日期稍迟,肿瘤大小无显著差异(P>0.05),HE发现肿瘤坏死程度没有显著差异,PDK1因子、MMP2、MMP9、E-cadherin和Vimentin的表达情况没有显著差异(P>0.05);与MGC803-CTR动物组转移瘤裸鼠相比,MGC803-si AC093818.1动物组肿瘤发生日期较迟,且肿瘤大小明显减小(P<0.05),HE发现肿瘤坏死程度明显升高,PDK1表达下调,侵袭转移相关因子MMP2、MMP9和Vimentin表达下调,E-cadherin表达上调。结论:在AC093818.1表达较高的肿瘤细胞中,抑制AC093818.1表达可以通过下调PDK1表达,间接调控相关侵袭转移基因表达,从而促进肿瘤坏死,减弱肿瘤侵袭转移能力。在AC093818.1表达较低的肿瘤细胞中,抑制AC093818.1表达对肿瘤的坏死及侵袭转移没有明显作用。