研究背景近年来显微成像技术发展迅速,显微镜分辨率达到纳米级,便于我们成像细胞精细结构,监测生物功能分子。然而,目前的技术用于成像较厚样本时仍需复杂的包埋、切片等制样操作。X射线显微镜（X-Ray Microscope,XRM）所用的X射线有强大的穿透力,无需复杂的制样操作即可对大尺度样品高分辨成像,但它在区分不同性质的细胞和生物分子时特异性较差,需要开发XRM适用的特异性标记物。现代生物医学的发展要求实现从整体到细胞、分子的多尺度成像模式。但目前还没有方便快捷的示踪方法帮助我们直接观察病毒在细胞中的复制和包装动态,迫切需要开发相应的标记物以便于成像细胞内的生物大分子如RNA。研究目的本研究进行了动物个体水平的X射线成像研究,重点开发基于模式生物果蝇遗传操作的细胞特异性标记方法,以期实现组织细胞特异性高分辨成像,希望构建的这种X射线成像方法具有非常好的组织细胞特异性。同时构建可被小分子荧光团标记的冠状病毒缺陷型基因组,以实现实时通过荧光显微镜成像跟踪活细胞内病毒RNA扩增动态。并优化快速核酸指数扩增技术,配合显微RNA示踪,为研究病毒RNA复制和包装建立一个灵活、快捷的活细胞实时监测和定量系统。研究方法1、根据果蝇遗传学,将启动子-Gal4转基因系和UAS（Upstream Activating Sequences）-靶基因转基因系杂交,构建特异性表达抗坏血酸过氧化物酶APEX2的果蝇遗传标记体系。使用显微镜结合分子生物学方法进行品系鉴定。2、通过低温化学方法（Cryo Chem Method,CCM）固定在神经脑胶质细胞中表达APEX2的果蝇完整头部,使用反应液浸泡进行APEX2底物递送后通过XRM成像。3、通过进食途径、化学试剂处理后整体浸泡、冷应激破坏肠道屏障、微量注射等不同方法进行底物递送,以进行个体水平上APEX2催化自由基反应,探索在个体水平上满足XRM成像要求的底物递送方法。4、通过合成生物学和分子克隆相关实验设计并制备PEDV和SARA-Co V-2基因组部分片段,构建含RNA适体RNA MangoⅡ的冠状病毒缺陷型基因组重组载体。通过化学合成获得膜通透性小分子荧光团TO1-生物素,用于活细胞内RNA分子的实时标记。5、通过各种策略相结合优化快速核酸指数扩增反应EXPAR,以抑制非特异性扩增现象,用于RNA分子的特异性快捷检测。研究结果1、在模式生物果蝇中,借助其Gal4/UAS转基因系统,成功构建了具有细胞特异性遗传标记APEX2的果蝇遗传标记体系。2、在体外条件下,在解剖组织中进行APEX2催化自由基反应的结果表明APEX2可催化均匀渗透到细胞内的底物释放自由基并引发特异性生物聚合反应,生成在荧光及明场下可见的深棕色3,3`-二氨基联苯胺（3,3`-Diaminobenzidine,DAB）多聚物。并证明在复杂的组织细胞环境中,酶APEX2催化的DAB聚合反应不存在假阳性现象。3、可用于高质量超微结构保存并与遗传标签APEX2催化反应兼容的CCM方法由于压力辅助快速冷冻的样品量限制不适用于完整成虫,也无法克服昆虫表面的疏水性几丁质层对反应的影响,推测可能与APEX2底物难以通过果蝇体表疏水性几丁质层扩散进入组织细胞有关。4、通过尝试不同方法将底物递送到完整果蝇体腔内,发现只有微量注射法可有效实现活体底物递送并在底物浓度较高区域引发特异性聚合反应。由于底物递送的非均一性,以及底物注射对体表结构的破坏,并不是一个理想的底物递送模式。5、通过将与小分子荧光团TO1-生物素高亲和力结合并显示强荧光的RNA MangoⅡ序列重复引入到设计的冠状病毒缺陷型干扰（Defective Interfering,DI）基因组中,构建了可被TO1-生物素特异性标记的冠状病毒DI RNA。通过荧光信号的活细胞成像,能够直接观察DI RNA的细胞内动态。因此,通过建立活细胞实时观测系统,可用来研究病毒RNA复制和包装的动力学。6、多策略结合对指数扩增反应EXPAR进行优化,以降低高背景信号,使其用于DI病毒的生物化学定量,建立一个独立的活细胞RNA定量体系。研究结论1、成功构建了一种基于遗传标记APEX2的细胞特异性标记方法,用于X射线全息成像,并在模式生物果蝇中进行了初步探索。在特异性表达APEX2的解剖组织中,反应底物可均匀渗透到细胞中触发APEX2催化反应。在底物整体递送方法中仅微量注射可实现有限的活体底物递送并在高浓度区域引发特异性聚合反应。2、小分子底物穿透昆虫体表及肠腔几丁质层的效率是利用该技术实现完整动物水平XRM成像需克服的主要技术瓶颈。3、成功构建了可被小分子荧光团标记的冠状病毒DI RNA,并使用各种策略优化了用于DI RNA定量的快速核酸指数扩增技术,建立了从影像和生物化学定量等方面表征病毒基因组复制与包装动态的两个独立的技术手段。