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目的:研究ITGB5在结直肠癌(CRC)中的临床价值及其在介导结直肠癌进展和转移中的作用。方法:1.GEO数据库下载结直肠癌(CRC)GSE39582数据集,运用R语言程序对数据集中所有基因进行KM生存分析&单因素分析,筛选出有总体生存期(OS)价值和无病生存期(DFS)预后价值的基因(以KM生存分析p<0.05&单因素分析p<0.05为过滤条件);随后,运用R语言程序分别对有OS和DFS预后价值的基因进行了多因素Cox分析,筛选出有独立预后价值的基因集。通过取交集,得到兼有OS和DFS独立预后价值的基因。2.在TIMER2.0数据库中对ITGB5的表达水平进行泛癌分析。对GSE39582、GSE23878、GSE25070和GSE44076四个CRC数据集中ITGB5的表达水平分别独立地进行差异分析。3.对GSE17538数据集中ITGB5的表达进行了独立地生存分析、单因素分析和多因素cox分析。对GSE39582和GSE17538数据集中ITGB5的生存价值进行了meta分析,并且运用了ROC曲线对ITGB5预测价值进行了评价。4.以ITGB5表达量的中位值把GSE39582数据集分为高表达组和低表达组,随后进行差异分析(log FC>0.5,p<0.05),得到了差异基因(DEGs)。以同样的方法对GSE17538数据集进行差异分析,得到了差异基因。取两个数据集中共同的差异基因,运用R程序进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。此外,使用GSEA软件在GSE39582和GSE17538数据集中对ITGB5基因进行了GSEA富集分析。5.RT-qPCR检测了15对新鲜CRC癌组织和癌旁正常组织中的ITGB5m RNA表达水平。蛋白印迹实验(WB)检测了五对新鲜CRC癌组织和癌旁正常组织中的ITGB5蛋白表达水平。组织免疫化学染色检测了15例癌旁正常组织和55例癌组织中的ITGB5蛋白表达水平。6.siRNA敲减SW480细胞和RKO细胞中ITGB5的表达水平。PCR和WB验证敲减效率。CCK-8实验检测各组细胞增殖能力,transwell实验检测各组细胞迁移、侵袭能力。WB检ITGB5敲减后Wnt信号通路和EMT发生过程相关蛋白的表达水平变化结果:1.筛选得到兼有OS和DFS独立预后价值的基因30个,排除在结直肠癌中已报道的基因(2020年10月前)、差异分析无意义的基因、非编码基因以及差异分析和生存分析相悖的基因(如log FC>0、HR<0或log FC<0、HR>0),最终选择ITGB5(整合素亚单位β5)作为了后续的研究基因。2.ITGB5在结肠腺癌、胃癌和肝癌等11种癌组织中高表达;同时,在CRC非配对数据集(GSE39582和GSE23878)和配对数据集(GSE25070和GSE44076)中,ITGB5在CRC癌组织中的表达水平均高于癌旁组织(p<0.01)。3.ITGB5的高表达与临床分期较晚相关(在GSE39582数据集,p=0.045;在GSE17538数据集,p=0.006),并且在GSE39582数据集中还显示与局部浸润较深(p=0.027)、远处转移(p=0.01)相关。同时,ITGB5在Stage III/IV、T3-4、淋巴转移和远处转移组中的表达水平相对较高(p<0.05)。4.在GSE39582或GSE17538数据集中,ITGB5高表达组的CRC患者OS和DFS较低(均p<0.05),并且在GSE17538数据集中疾病特异性生存率(DSS)较低(p<0.05)。对两个GEO数据集的Meta分析显示,ITGB5是OS(p=0.0002)和DFS(p<0.0001)预后不良的高危因素。ROC曲线分析显示,在两个数据集中第3年、5年、8年的AUC曲线下面积均大于0.6,提示ITGB5对DFS具有一定的预测能力。5.在GSE39582数据集,单因素Cox分析显示:临床分期较晚(stage III/IV)、淋巴结转移、远处转移和ITGB5的表达升高是CRC患者OS和DFS的预后不良因素;同时,局部浸润较深(T3-4)也是DFS的预后不良因素。多因素Cox分析显示:远处转移和ITGB5的表达升高是CRC患者OS和DFS的独立高风险因子;同时,临床分期较晚和局部浸润较深也是CRC患者DFS的独立高风险因子。此外,在GSE17538数据集中的多因素分析也显示ITGB5是CRC患者DFS的独立高风险因子。6.在GSE39582和GSE17538数据集中对ITGB5高表达和低表达组分别进行了差异表达分析,得到165个共同差异表达基因。对这些共同差异基因进行了GO分析,结果显示可富集到多个extracellular matrix相关的GO term(p<0.05&q<0.05);同时,KEGG通路分析显示,可富集到Protein digestion and absorption、Focal adhesion、PI3K-Akt signaling pathway、Human papillomavirus infection和ECM-receptor interaction等信号通路(p<0.05)。7.对GSE39582和GSE17538两个数据集GSEA分析显示,ITGB5的高表达均可富集到Focal adhesion、ECM-receptor interaction、Pathways in cancer和Wnt signaling pathway等信号通路(NOM p-value<0.05)。8.在验证实验中,RT-PCR实验显示CRC癌组织中ITGB5 m RNA表达水平水平高于癌旁组织(p<0.001)。WB实验和免疫组化也显示在CRC癌组织中ITGB5蛋白表达水平高于癌旁组织(p<0.05)。同时,免疫组化结果还显示出,ITGB5的高表达与临床分期较晚(p=0.002)、局部浸润较深(p=0.024)、淋巴结转移(p=0.049)和远处转移(p=0.043)相关。9.在SW480细胞和RKO细胞中,qPCR实验显示两条靶向ITGB5的siRNA序列均有较高的敲减效率(p<0.001),WB实验验证了qPCR的结果(p<0.001)。10.CCK-8实验显示,CRC细胞系ITGB5敲减后在48h和72h所测得的OD值均低于对照组各时段(p<0.05),表明细胞增殖能力减弱。Transwell迁移、侵袭实验显示,ITGB5敲减后迁移数目明显减少(p<0.01),侵袭细胞数目也明显减少(p<0.01)。11.WB实验显示CRC细胞系ITGB5敲减后,β-catenin、c-Myc、Cyclin D1、MMP-9、Vimentin和N-cadherin表达均下调,而E-cadherin表达上调,提示ITGB5的敲减阻滞了Wnt信号通路和EMT的发生。结论:1.ITGB5在结直肠癌等多种癌组织中高表达,与CRC的临床分期、浸润深度、淋巴转移和远处转移相关。2.ITGB5高表达的CRC患者OS、DSS和DFS预后较差;ITGB5是CRC患者DFS的独立高风险因子,且对DFS具有一定的预测能力。3.ITGB5可能通过Wnt信号通路促进了结直肠癌的发展和转移。