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研究背景肺动脉高压（pulmonary arterialhypertension,PAH）是一种威胁生命的疾病,其特征是肺动脉血管细胞的过度增殖,主要包括平滑肌和内皮细胞。增殖过度的细胞会引起肺部血管进行性闭塞,造成肺血管重构（pulmonary vascular remodeling,PVR）,最终推动肺部和右心压力升高,引发不可逆转性病变。当前已有大量研究证实PVR在PAH进展中发挥至关重要的作用。由于临床上针对PAH的治疗主要集中在血管收缩机制而忽视了 PVR的重要作用,目前还没有有效的方法可预防PAH的进展,因此提高对PVR发展进程中的细胞及分子机制的认识,寻找新的有效的治疗PVR的靶点至关重要。以往研究证明,肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs）的过度增殖、迁移和凋亡抑制改变是PVR最主要的病理和生理学基础。染色体结构维持蛋白 4（Structural maintenance of chromosomes 4,SMC4）是染色体结构维持蛋白家族系列核心成员之一。SMC4在细胞有丝分裂过程中与SMC2形成一个凝集素复合体,并且作用于染色体的集缩和分离。近期研究发现,SMC4参与多种细胞的非有丝分裂功能,包括异染色质的组织、维持基因表达的沉默状态以及DNA修复等过程。越来越多的证据表明,SMC4与肿瘤的发病机制高度相关,参与调控多种癌细胞的增殖和迁移功能改变。既往研究表明,多种肿瘤机制参与PAH发病,重构血管区存在大量类癌样增殖的血管平滑肌细胞。前期生物信息学研究发现,SMC4在PAH患者和健康者的肺组织中表达存在明显差异,GEO（Gene Expression Omnibus）数据库中肺发育数据集GSE43767表达网络分析显示,SMC4随着肺发育成熟表达降低,在增殖活跃的肺腺癌细胞内SMC4表达升高。最近研究显示,SMC4参与调控细胞周期,与细胞的分化、增殖和凋亡过程显著相关。因此我们推测,SMC4可能在肺部重构血管区高表达,并在PASMCs病理性增殖和PVR形成中发挥作用,但SMC4在PVR和PASMCs中的具体作用及其潜在机制尚不明确。研究目的1.探究SMC4在PVR大鼠肺动脉组织和PASMCs中的表达水平。2.探究SMC4对PDGF-BB诱发的PASMCs功能改变的影响。3.探究SMC4影响肺血管重构的潜在机制。4.为PVR和PAH治疗提供新的潜在的药物治疗靶点。研究方法1.动物实验:将SD大鼠随机分为4组:正常对照组（Control组）、肺血管重构组（MCT组）、慢病毒阴性对照组（MCT+Lenti-shNC组）、慢病毒敲低组（MCT+Lenti-shSMC4）,通过慢病毒滴鼻方式敲低大鼠体内SMC4表达,2周后取大鼠肺动脉组织检验SMC4敲低效果,同时皮下注射MCT（60mg/kg）建立PVR模型,为期4周。取肺组织行H＆E染色实验观察血管形态结构改变和血管重构情况;免疫荧光双染以确定SMC4和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在肺动脉中的表达和定位。2.细胞实验:提取大鼠肺动脉平滑肌细胞随机分为4组:正常对照组（Control组）、体外PVR模型组（PDGF组）、阴性干扰对照组（Si-NC组）、干扰组（Si-SMC4组）。QRT-PCR 和 Western Blotting 检测 SMC4 表达;CCK8、EDU 检测细胞增殖;Western Blotting测定细胞凋亡相关蛋白的表达;细胞划痕和Transwell小室检测细胞迁移;Western Blotting测定PASMCs表型转化以及NF-κB信号通路相关蛋白表达。研究结果1.SMC4在MCT诱导的大鼠肺动脉组织表达增加QRT-PCR和Western Blotting结果提示,MCT模型组肺动脉SMC4表达明显高于对照组;肺组织免疫荧光染色结果表明SMC4在重构肺动脉血管区表达增加。2.SMC4在PDGF-BB诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞中表达增加我们分别用 0、1、10、20ng/ml 浓度的 PDGF-BB 刺激 PASMCs 24 小时,qRT-PCR和Western Blotting实验发现,无论是在RNA水平还是在蛋白水平,在20ng/ml药物浓度刺激条件下,SMC4水平相对于对照组显著增高。3.SMC4促进PDGF-BB诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖、迁移和凋亡抵抗我们选择针对SMC4的过表达慢病毒和小干扰RNA分别处理细胞。CCK8和EDU结果显示,敲除SMC4阻断了 PDGF-BB诱导的细胞增殖,过表达反之;Western Blotting发现SMC4的敲除增强了被PDGF-BB预先抑制的Bax和caspase 3表达,降低了 PDGF-BB诱导的Bcl-2表达,加速PDGF-BB抑制的PASMCs凋亡;Transwell和细胞划痕显示,SMC4的敲减明显削弱了 PASMCs的迁移。4.SMC4加速PDGF-BB诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞表型转化我们选择针对SMC4的小干扰RNA处理细胞。Western Blotting结果显示,敲除SMC4明显抑制PDGF-BB诱导的Collagen-1和OPN蛋白的表达,同时上调被抑制的α-SMA和SM22α蛋白的表达,提示SMC4增强PDGF-BB诱导的PASMCs的表型转化。5.SMC4可能通过激活NF-κB信号通路在PASMCs功能改变中发挥作用我们分别利用NF-κB通路抑制剂BAY11-7082和针对SMC4的小干扰RNA处理PASMCs,发现敲除细胞内SMC4显著抑制PDGF-BB诱导的NF-κB通路的磷酸化水平,这一作用与BAY11-7082作用相一致。6.敲低大鼠体内SMC4水平抑制MCT诱导的大鼠肺血管重构和NF-κB磷酸化水平我们使用针对SMC4的慢病毒敲减大鼠体内SMC4,Western Blotting结果发现敲低SMC4水平能显著缓解MCT引起的大鼠肺血管重构和NF-κB通路的磷酸化水平。研究结论1.SMC4在MCT诱导的PVR大鼠肺动脉和PDGF-BB诱导的PASMCs中高表达。2.SMC4促进PDGF-BB诱导的PASMCs增殖、迁移和凋亡抵抗。3.SMC4促进PDGF-BB诱导的PASMCs表型转化。4.SMC4可能通过NF-κB通路参与PVR发生、发展。