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研究背景多形性胶质母细胞瘤(GBM,WHO IV)是最常见的原发性脑肿瘤类型,约占所有原发性脑肿瘤的51.4%,仍然是颅内癌症相关死亡的主要原因。目前,最大限度地安全切除并在术后辅助电离辐射治疗和替莫唑胺化疗是新诊断患者的标准治疗方法。然而,在过去十年中,中位生存期没有得到改善,仅限于14.6个月。在化疗、放疗和免疫疗法之外,开发新的抗癌策略对胶质瘤患者来说至关重要。因此,迫切需要低毒、有效的药物来治疗胶质瘤并延长患者的生存期。天然成分提取物在以往一直是潜在癌症疗法的重要药物。蟾素主要为两栖纲蟾科中华大蟾蜍(Bufo Gargarizans Cantor)或黑眶蟾蜍(Bufo Melanostictus Schneider)皮脂腺分泌物的提取物,是一种广泛应用的传统中药,表现出抗炎、解毒、镇痛、刺激和抗癌等多种药理活性。据报道,蟾素能明显抑制胶质瘤、肺癌和乳腺癌的恶性进展。蟾毒素配基(Resibufogenin,RB),也叫蟾毒配基(Bufogenin)和酯蟾毒配基(Recibufogenin),是华蟾素(Cinobufacini)的主要活性成分之一。近年来,RB已被广泛用于各种肿瘤的治疗研究。例如RB已被证明通过蛋白激酶C依赖性抑制GSK-3从而抑制胰腺癌中TAK1介导的NF-κB活性。此外,RB通过抑制PI3K/AKT和肌动蛋白细胞骨架信号通路,抑制了卵巢透明细胞癌的恶性进展。然而RB对胶质瘤的影响和分子机制还没有被阐明。胶质瘤细胞的周期失调是其恶性增殖的主要原因,也是目前肿瘤药物开发的典型治疗靶点。细胞G2/M期转换是由CDK1-Cyclin B复合物的激活所介导的。其中CDK1(cyclin-dependent kinase 1)的激活依赖于 CDC25C(cell division cycle 25C)对 CDK1 蛋白Tyr15位点的去磷酸化。据报道,p21通过下调CDK1和Cyclin B复合物的表达,诱导G2/M期阻滞。由丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKs)介导的信号传递已被证明在调节细胞周期循环和细胞对DNA(deoxyribonucleic acid)损伤的反应中起着关键作用。根据其序列的相似性及其上游激活剂的性质,MAPKs被归入三个亚家族:ERK1/2、JNK/SAPK 和 p38。细胞外信号调节激酶(extracellularregulated protein kinases,ERK1/2)是细胞外信号的主要传递者之一,它将膜基受体的刺激与细胞功能的变化联系起来。ERK1/2的短暂激活在细胞增殖中起着举足轻重的作用,持续的ERK激活通过促进CDC25C泛素化和蛋白体降解以及上调p21的表达而诱导细胞周期阻滞。此外,新开发的临床药物Ibrance是美国食品和药物管理局在2015年批准的第一个CDK4/6抑制剂,靶向肿瘤细胞周期,对特定类型的乳腺癌有有效且安全的治疗效果。除了胶质瘤不可控制的增殖外,高度侵袭性亦是其恶性表型之一。与整合素相关的黏着斑复合物提供了细胞与细胞外基质粘附的主要部位,并与肌动蛋白细胞骨架结合以控制细胞的运动。黏着斑的动态调节和相关肌动蛋白细胞骨架的重组是决定细胞侵袭的关键因素。黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)最初被确定为由SRC(non-receptor tyrosine kinase)肿瘤基因转化的细胞中的一种酪氨酸磷酸化蛋白,后来发现它通过SH2结构域介导的相互作用与SRC结合。FAK-SRC复合物结合并磷酸化各种蛋白,如P130cas和Paxillin,以促进肿瘤细胞的侵袭。此外,无处不在的第二信使钙离子(Ca2+)早已被认为通过参与黏着斑复合物的组装和拆卸从而调控细胞侵袭。鉴定RB在胶质瘤细胞的作用靶点将使我们更好地了解RB抑制胶质瘤的分子机制,从而为胶质瘤带来全新的治疗策略。据报道,蟾素是钠钾泵酶(Na+-K+-ATPase)的抑制剂。Na+-K+-ATPase是一种能够分解ATP从而获得能量的膜蛋白,并通过此能量实现对Na+、K+的主动转运。ATP1A1(Na+-K+-ATPase α1)是在人类中发现的 Na+-K+-ATPase α亚基的4种亚型之一。当Na+-K+-ATPase仅被部分抑制时,细胞内Na+和K+的平衡没有明显破坏。当被适当配体激活后,Na+-K+-ATPase便会促进正常细胞的增殖,或者相反地,抑制肿瘤细胞的增殖。因此,探索RB在胶质瘤中的机制将为胶质瘤的靶向分子治疗提供新的临床药物。目的探索蟾毒素配基对胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的影响和机制方法(1)半数最大抑制浓度(IC50)实验计算RB在人星形胶质细胞(normal human astrocyte,NHA)、胶质瘤原代细胞和胶质瘤细胞系的半数最大抑制浓度。使用CCK-8,EdU,细胞克隆形成,细胞周期分布等实验体外评估RB对GBM增殖的影响。应用transwell,3D-侵袭球实验和类脑-侵袭球共培养实验体外评估RB对GBM侵袭的影响。Western blot检测RB对GBM增殖,周期调控和侵袭相关指标的影响。(2)进行全基因组测序,对差异基因进行富集分析。Western Blot检测RB对富集到的增殖和侵袭通路相关蛋白表达量的影响。周期实验、transwell和western blot实验验证富集通路与RB诱导的周期阻滞和侵袭抑制的关系。(3)使用BioSolveIT SeeSAR软件预测RB抑制胶质瘤细胞的靶点蛋白并检验对该靶点蛋白表达和活性调控的影响。敲减或过表达胶质瘤细胞中的该靶点蛋白验证其对RB抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭表型的关系。(4)构建原代细胞P3#GBM裸鼠颅内原位表达模型,记录RB对荷瘤小鼠生存期的影响。处死小鼠后IHC染色观察靶点蛋白和Ki-67的表达量。结果(1)CCK-8实验显示RB在较低浓度下即可抑制胶质瘤原代细胞P3#GBM(IC50=2.29 μM)和胶质瘤细胞系 U251(IC50=3.04 μM)和 A172(IC50=6.21μM)的增殖活力。与胶质瘤细胞相比,正常星形胶质细胞(IC50=32.66μM)仅在较高浓度时表现出增殖抑制,提示RB在一定浓度时可能对抑制GBM细胞增殖更为敏感。(2)CCK-8、细胞克隆形成和EdU试验的研究结果表明,2和4 μM RB对P3#GBM、U251和A172的增殖活力有明显抑制效应。细胞周期分布试验结果说明,RB诱导 GBM细胞 G2/M期阻滞。Western blot 检测发现RB 通过调控p21/CDC25C/CDK1/Cyclin B的表达诱导胶质瘤细胞周期阻滞在G2/M期。(3)Transwell,3D-细胞侵袭球实验和大鼠类脑-胶质瘤细胞侵袭球实验结果显示RB抑制GBM细胞的侵袭。Western blot检测发现RB通过下调EMT相关蛋白的表达从而抑制了胶质瘤细胞的侵袭。(4)转录组测序显示RB处理后MAPK通路明显富集。Western blot实验显示RB激活了 MAPK/ERK通路。ERK1/2抑制剂(U0126)挽救了 RB诱导的周期阻滞。(5)转录组测序显示RB处理后focal adhesion信号通路明显富集。Western blot实验显示RB抑制了 SRC/FAK/Paxillin信号通路。细胞内钙离子检测实验表明RB通过诱导细胞内钙离子累积,抑制了 SRC/FAK/Paxillin黏着斑信号通路介导的胶质瘤细胞侵袭。(6)BioSolveIT SeeSAR软件预测到RB靶向胶质瘤细胞ATP1A1蛋白。(7)钠钾泵酶活性实验检测到RB促进了胶质瘤细胞钠钾泵酶活性。活性氧(reactive oxygen species,ROS)实验检测到RB通过激活胶质瘤细胞的钠钾泵酶活性,关闭了 ROS/Na+-K+-ATPase放大环路。Western blot实验表明RB促进了胶质瘤细胞ATP1A1的蛋白表达水平,进一步研究表明RB通过靶向ATP1A1信号联级触发细胞内MAPK/ERK信号通路导致周期阻滞和抑制SRC/FAK/Paxillin黏着斑信号通路抑制GBM的恶性进展。(8)在P3#GBM颅内原位种瘤模型中,给予小鼠RB腹腔注射治疗(10 mg/kg/day),荷瘤小鼠中位生存期显著延长(n=10,26天vs29天,P=0.0082),并且在种瘤后第21天,给药组的荧光信号比对照组低近42%(n=10,P=0.0012)。同时免疫组化实验表明RB治疗组Ki-67明显降低。结论当RB与ATP1A1结合时,钠钾泵作为受体被激活,触发胞内MAPK/ERK信号通路从而诱导胶质瘤细胞G2/M期阻滞和升高胞内钙离子水平从而抑制SRC/FAK/Paxillin黏着斑信号通路,最终抑制胶质瘤的增殖和侵袭能力。