【摘 要】
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目的:1.研究信号素3A(Semaphorin3A,Sema3A)对SD大鼠骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)增殖和成骨分化的影响;2.初步探讨ERK信号通路在Sema3A对SD
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目的:1.研究信号素3A(Semaphorin3A,Sema3A)对SD大鼠骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)增殖和成骨分化的影响;2.初步探讨ERK信号通路在Sema3A对SD大鼠BMSCs成骨向分化影响中的作用。方法:体外分离培养并扩增SD大鼠BMSCs,并做成骨、成脂向诱导分化及流式细胞鉴定后用于本实验。1.使用重组Sema3A因子(0.5ug/ml和1ug/ml)处理细胞,采用MTT法检测Sema3A对BMSCs增殖的影响;3d后,采用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)法检测BMSCs成骨相关基因碱性磷酸酶(ALP),骨钙素(OCN)及Runx2 mRNA表达的变化;7d后采用酶比活性法检测细胞ALP活性;14d后用茜素红染色法检测Sema3A对BMSCs形成矿化结节的影响。2.使用重组Sema3A因子处理细胞3d后,Western Blot法检测ERK1/2以及p-ERK1/2蛋白水平的变化。加入ERK1/2信号通路特异性抑制剂PD98059后再用Sema3A处理细胞,作用3d后用Western Blot法检测ERK1/2及p-ERK1/2蛋白水平以及q RT-PCR法检测成骨相关基因的变化;处理细胞7d后,茜素红染色法检测矿化结节的形成。结果:分离培养得到的BMSCs经鉴定具有成骨、成脂向分化的能力,细胞表面抗原CD45(-),CD29(+),CD54(+),CD90(+)。1.使用重组Sema3A因子处理BMSCs后,MTT结果显示Sema3A因子对BMSCs的增殖无明显影响;q RT-PCR检测结果显示在两个浓度的Sema3A处理组BMSCs成骨相关的基因ALP,OCN和Runx2 mRNA的表达量均比对照组低(P<0.05);细胞碱性磷酸酶活性在Sema3A处理组比对照组降低(P<0.05);茜素红染色结果显示BMSCs经Sema3A处理后矿化结节形成的量明显减少。2.Western Blot结果显示ERK1/2蛋白磷酸化水平在成骨诱导组降低,而Sema3A处理细胞后可以使其水平升高。用ERK1/2信号通路特异性抑制剂PD98059处理细胞后,ERK1/2蛋白磷酸化水平明显降低。Sema3A显著抑制ALP,OCN及Runx2 mRNA的水平和矿化结节形成的量,但ERK信号通路被PD98059阻断后,Sema3A的作用则明显被减弱。结论:Sema3A对BMSCs的增殖无明显影响,但抑制其成骨分化。这种抑制作用可能是Sema3A激活了ERK信号通路,使ERK1/2蛋白磷酸化水平升高而发挥作用。
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