【摘 要】
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酪蛋白糖巨肽（CGMP）是由κ-酪蛋白经凝乳酶酶解得到的一种糖基化多肽,不含苯丙氨酸,含有丰富的唾液酸糖基,具有抗菌消炎、抑菌解毒、促进婴幼儿大脑发育的功效,因此CGMP不仅可以作为苯丙酮尿症人群的特膳食品,还可以作为婴幼儿配方奶粉的添加成分。然而由于技术制约,我国尚未出台食品中CGMP的检测标准。CGMP产品的分析检测涉及分离纯化与定性定量两类技术。目前CGMP的纯化方法主要依据CGMP和杂蛋白
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酪蛋白糖巨肽（CGMP）是由κ-酪蛋白经凝乳酶酶解得到的一种糖基化多肽,不含苯丙氨酸,含有丰富的唾液酸糖基,具有抗菌消炎、抑菌解毒、促进婴幼儿大脑发育的功效,因此CGMP不仅可以作为苯丙酮尿症人群的特膳食品,还可以作为婴幼儿配方奶粉的添加成分。然而由于技术制约,我国尚未出台食品中CGMP的检测标准。CGMP产品的分析检测涉及分离纯化与定性定量两类技术。目前CGMP的纯化方法主要依据CGMP和杂蛋白/多肽的溶解性、相对分子质量和荷电性差异进行分离纯化,特异性不高,产物含有大量杂蛋白/多肽。CGMP的间接检测方法误差大、易受干扰、无法反映真实的CGMP含量,而因CGMP糖基修饰种类丰富、程度不一,基于液相色谱-质谱联用对CGMP直接分析得到的谱图信息非常复杂、难以分析。因此,亟需开发特异性高的CGMP分离纯化方法以减少杂蛋白/多肽的干扰,同时建立基于高效液相色谱串联质谱联用（HPLC-MS/MS）对CGMP的精确分析方法。本论文针对上述两方面问题,构建了一种基于硼亲和固相萃取纯化结合HPLC-MS/MS精确定性、定量分析CGMP的新方法,为含CGMP食品的分析检测和产品监管提供参考。具体研究内容如下:（1）合成了苯硼酸基团修饰的介孔二氧化硅纳米粒子（CPBA-MSNs）,并探究了其与唾液酸这一CGMP特征糖基之间的吸附行为,发现CPBA-MSNs可以在pH 4.0的环境中高效、特异性吸附唾液酸,并在pH 1.0时洗脱,吸附模型接近Langmuir模型。之后以酪蛋白酶解液为模式体系,使用CPBA-MSNs对其中的CGMP固相萃取纯化,以MALDI-TOF MS分析质荷比分布,以考马斯亮蓝法测定蛋白质含量,间苯二酚-盐酸法测定唾液酸含量,以及CGMP相对纯度三个指标对吸附pH、吸附时间、淋洗次数、洗脱pH、洗脱时间和吸附剂用量六个条件进行优化,在吸附pH 4.5、吸附时间20 min、淋洗次数3次、洗脱pH 1.2、洗脱时间5 min、吸附剂用量20 mg条件下,获得的CGMP相对纯度为0.957,每100 g蛋白质等同物中唾液酸含量为13.15 g,回收率（以唾液酸计）为71.72%,证明所开发的方法可于复杂体系中高效、选择性提取纯化CGMP,同时所制备的CGMP可以作为其分析方法中的参照品。（2）以经上述提纯制备的CGMP为参照,以体积排阻色谱和SDS-PAGE分析CGMP单聚体和多聚体的相对分子质量分布,并作为CGMP初步定性指标,通过蛋白酶K将CGMP酶解,结合蛋白质数据库比对,选取三个非糖基化的特征肽段作为CGMP精确定性指标。通过HPLC-ESI-Q-TOF MS分析,最终选取了目标肽段2（EDSPEV）作为CGMP的定量肽段。通过HPLC-ESI-Qq Q MS开发了基于目标肽段2的CGMP定量方法,以675/298为定量离子对检测CGMP,线性范围为0.5-200μg/m L,并通过换算公式确定CGMP的浓度,初步确定了CGMP的定量检测方案。最后,以定性和定量结果作为CGMP的质量指标,以唾液酸糖基含量作为CGMP的分级指标,拟定了一种食品中CGMP的定性、定量、定级方案。
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