【摘 要】
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羊肉掺伪是现今食品质量安全领域的重要问题。受经济利益驱使,羊肉中掺入鸭肉的现象已被多次报道,不仅侵害消费者利益,影响市场经济运行,违反相关法规,而且易引起过敏和突发卫生事件。因此,开发准确、灵敏且快速的羊肉中鸭肉源掺伪鉴定方法具有重要的现实意义。本研究将跨越式滚环等温扩增（Saltatory rolling circle amplification,SRCA）技术与荧光技术相结合,开发了实时荧光定
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羊肉掺伪是现今食品质量安全领域的重要问题。受经济利益驱使,羊肉中掺入鸭肉的现象已被多次报道,不仅侵害消费者利益,影响市场经济运行,违反相关法规,而且易引起过敏和突发卫生事件。因此,开发准确、灵敏且快速的羊肉中鸭肉源掺伪鉴定方法具有重要的现实意义。本研究将跨越式滚环等温扩增（Saltatory rolling circle amplification,SRCA）技术与荧光技术相结合,开发了实时荧光定量SRCA（Real-time quantitative SRCA,qSRCA）定量检测和可视化SRCA定性检测两种方法,用于鉴定羊肉中的鸭肉源成分。以生长激素（Growth hormone,GH）基因为靶基因,设计羊、鸭特异性引物,并筛选出适宜引物,同时对反应体系进行优化,最终建立了鉴别羊肉中鸭肉源成分的qSRCA定量检测和可视化SRCA定性检测方法。（一）对建立的qSRCA定量检测羊、鸭的方法分别进行特异性、绝对灵敏度、相对灵敏度试验、人工模拟掺伪检测试验以及实样检测,并与qPCR定量方法进行比较,以评估qSRCA定量检测方法。试验结果显示:在特异性试验中,山羊和绵羊样品均为阳性,10种非羊样品均为阴性。鸭样品为阳性,11种非鸭样品均为阴性。以上结果表明方法特异性良好。qSRCA检测羊DNA的绝对灵敏度为2.0×101 fg/μL,是qPCR的1000倍;qSRCA检测鸭DNA的绝对灵敏度为2.0×101 fg/μL,是qPCR的1000倍。qSRCA检测二元混合物中的羊DNA相对灵敏度为0.001%（v/v）,是qPCR的1000倍;qSRCA检测二元混合物中的鸭DNA相对灵敏度为0.001%（v/v）,是qPCR的1000倍。因此,qSRCA检测方法特异性强、灵敏度高。在人工模拟掺伪检测试验中,将不同比例的鸭肉人工污染羊肉,进行qSRCA定量检测试验。qSRCA检测方法的相对误差在-20.00%～13.00%之间（＜±25%）,变异系数在0.96%～4.63%之间。因此,该方法准确度、精密度较高。采用行业标准《NY/T 3309-2018》、qPCR和qSRCA三种方法分别对29份市售羊肉样品进行实样检测。结果表明:行业标准《NY/T 3309-2018》和qPCR检测鸭肉源成分的检出率均为10.34%,qSRCA检测鸭肉源成分的检出率为17.24%,检出率明显高于其他两种方法。（二）对建立的可视化SRCA定性检测羊、鸭的方法进行特异性、灵敏度和检出限试验,以评估其定性检测性能。试验结果显示:山羊和绵羊样品均呈现肉眼可见的绿色荧光,判定为阳性结果,13种非羊样品均呈现肉眼可见的橙黄色荧光,判定为阴性结果。鸭样品呈现肉眼可见的绿色荧光,判定为阳性结果,14种非鸭样品均呈现肉眼可见的橙黄色荧光,判定为阴性结果。因此,该检测方法特异性良好;可视化SRCA分别检测羊、鸭DNA的灵敏度均为2.0×101 fg/μL;可视化SRCA检测羊肉中鸭肉源成分的检出限为0.001%（w/w）。市售商业样品检测中,采用可视化SRCA检测羊肉样品中的鸭肉源成分,并与现行行标《NY/T3309-2018》进行比较,其检出率为17.24%,比行标高6.9%。综上,本研究建立的qSRCA定量和可视化SRCA定性检测方法能较好的鉴定羊肉中的鸭肉源成分,以上两类检测方法均具有检测结果准确、快速、灵敏的优势,但可视化SRCA定性检测方法具有简便、结果肉眼可见的优势。因此,qSRCA定量检测方法可应用于条件相对较好的实验室或检测机构进行定量检测,可视化SRCA定性检测更适用于条件相对落后的实验室或资源相对匮乏的基层检测机构。
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