【摘 要】
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[目 的]随着生活方式的变化,骨缺损疾病变得越来越多见。目前经典的治疗方法是自体骨移植,但是这种方案有供骨区并发症的缺点。近年来应用骨组织工程替代自体骨移植治疗骨缺损越发受到关注,可行的替代物主要结构包括骨组织有机成分或者无机成分及具有较好生物活性的高分子材料。高分子材料有利于细胞的黏附,有着较好的生物相容性,缺点是缺乏足够的机械强度,PLGA是常见的一类高分子材料,它有着较大的比表面积,有利于细
【基金项目】
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昆医联合专项项目（2017FE468（-145））；
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[目 的]随着生活方式的变化,骨缺损疾病变得越来越多见。目前经典的治疗方法是自体骨移植,但是这种方案有供骨区并发症的缺点。近年来应用骨组织工程替代自体骨移植治疗骨缺损越发受到关注,可行的替代物主要结构包括骨组织有机成分或者无机成分及具有较好生物活性的高分子材料。高分子材料有利于细胞的黏附,有着较好的生物相容性,缺点是缺乏足够的机械强度,PLGA是常见的一类高分子材料,它有着较大的比表面积,有利于细胞的黏附,促进细胞的增殖。羟基磷灰石（HA）存在于人体骨组织中,它的结构与人体骨组织高度相似,有着较好的生物活性,但是生物脆性较差。纳米金刚石（ND）是存在于自然界的一种纳米材料,有着较强的机械性能和较低的生物毒性,ND不能促进细胞的生长与发育。本课题拟将PLGA、ND和HA三种材料制备成新型三相复合材料,对其进行材料学评价,进行药物释放实验和复合材料的降解实验,评估体外的成骨能力,并植入大鼠颅骨评估体内成骨能力。[方 法]本课题将PLGA与ND结合组成PLGA-ND复合体,加入HA制备成新的ND/HA-PS（纳米金刚石-羟基磷灰石-聚乳酸-羟基乙酸共聚物复合材料）,HA-PS（羟基磷灰石-聚乳酸-羟基乙酸共聚物复合材料）、ND-PS（纳米金刚石-聚乳酸-羟基乙酸共聚物复合材料）、pPS（聚乳酸-羟基乙酸共聚物复合材料）四种类型的支架,通过3D打印技术制造成型,观察复合材料的外貌特征。将BMP-2分别负载于四种支架上,检测30天内BMP-2的释放与复合材料的降解能力。选用小鼠脂肪间充质干细胞接种到各个支架上,于第3天和第15天评估支架的细胞体外增殖情况、形态学、细胞免疫荧光学及生物分子学活性,随后用SD大鼠建立颅骨缺损模型,将复合材料植入颅骨缺损部位,大鼠饲养3月后取出材料、切片观察毒性反应及成骨性能。[结 果]B-ND/HA-PS与其他复合材料相比,BMP-2 30天内释放量不超过总量的70%,而B-ND/HA-PS 30天内降解质量只有总质量的10%,这说明该材料能在骨缺损修复初期提供良好的填充及支撑作用,且能释放足量的BMP-2,促进骨愈合,B-ND/HA-PS上的干细胞培养15天后采用CCK-8检测结果提示细胞活性明显高于其他实验组。用CLSM分别观察培养第3天和第15天的细胞群落,第15天四组复合物上的细胞均较第3天明显增多,第15天的B-ND/HA-PS和B-HA-PS上的细胞与B-ND-PS和B-pPS上的细胞相比,前两组的细胞分布更为均匀。用SEM观察培养15天的干细胞,B-ND/HA-PS、B-HA-PS和B-ND-PS上的细胞形态呈现出细长的纤维状,细胞间的联系紧密。B-pPS上的细胞的形状无规则的形状。而细胞免疫荧光学结果表明B-ND/HA-PS和B-HA-PS细胞COL-1表达量增多,细胞分布更为均匀,细胞之间的联系更为紧密。B-ND/HA-PS组在细胞培养第15天后ALP表达量明显多于其他三组。B-ND/HA-PS和B-HA-PS成骨正相关基因Runx2、OCN、COL-1、OPN 表达多于 B-ND-PS 和 B-pPS,B-ND/HA-PS 和 B-HA-PS 成骨负相关基因BSP表达少于B-ND-PS和B-pPS。动物实验的B-ND/HA-PS组的OCN表达量明显多余其他实验组,Micro-CT扫描结果显示B-ND/HA-PS组和B-HA-PS组可见明显的骨沉积现象。B-ND/HA-PS、B-HA-PS和B-ND-PS切片的H＆E染色未见明显的炎症细胞,B-pPS组切片可见明显的炎症细胞。[结 论]本实验成功制备出B-ND/HA-PS、HA-PS、ND-PS及pPS四种复合物,B-ND/HA-PS的BMP-2释放能力较强,B-ND/HA-PS降解速率较慢,它在体外细胞实验中表现出较好的细胞增殖效果和较强的细胞活性。在成骨相关因子检测的实验中,各种成骨正相关因子表达都有明显的增多;在动物实验中,B-ND/HA-PS植入大鼠体内后,大鼠未见明显的炎症反应,饲养3月取出材料,发现B-ND/HA-PS有着较低的生物毒性和较好的骨沉积效果,因此,该材料有望应用于临床骨缺损的治疗。
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