基于PCR的副溶血性弧菌血清分型和致病性的分析模型构建

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副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)属于革兰阴性嗜盐性弧菌,可在水生动物的肠道内粘附、聚集和繁殖,因此广泛分布于海产品及海域环境,淡水产品和淡水养殖环境中也可检出该菌,人摄入被该菌污染的食品后可引发中毒,不仅给水产养殖业带来巨大损失,同时严重危害人类健康。近年来,由副溶血性弧菌引发的疾病已经跃居我国食源性致病菌榜首。并非所有的副溶血性弧菌对人类均可致病。引起食源性疾病暴发的副溶血性弧菌主要集中在少数几个血清型,因此基于副溶血性弧菌血清型鉴定的菌株筛选方法对获得强致病力菌株尤为重要。目前,副溶血性弧菌血清型鉴定方法主要依赖传统血清凝集法,该法实验程序复杂、耗时较长、对检验人员的技术要求高、血清保质期短且成本较高,严重制约了实验进程。本研究建立了一种基于聚合酶链式反应(Polymerase Ch ain Reaction,PCR)技术的副溶血性弧菌血清分型方法,并用此方法对我国2017年食品安全风险监测网收集的副溶血性弧菌进行血清型分析。为了全面掌握我国水产品中副溶血性弧菌耐药性分布和产毒特征,本研究同时采用微量肉汤稀释法测定了该菌对临床治疗常用的8类共12种抗生素的药物敏感性,并采用荧光定量多重PCR方法,对该菌常携带的tlh、tox R、tdh、trh1、trh2、orf8等6种毒力基因进行检测。主要研究结果如下:(1)采用荧光定量PCR方法对2017年来自14个省、自治区、直辖市的食品来源的1194株副溶血性菌株进行菌种鉴定和毒力基因检测,结果显示:本研究中所有受试菌株均确证为副溶血性弧菌,tlh和tox R基因的阳性率分别为100%和98.2%;毒力基因tdh、orf8、trh1、trh2基因的阳性率分别为4.02%、1.59%、0.34%和3.35%,其中福建省来源的副溶血性弧菌的毒力基因阳性率最高(34%),其次是浙江、河南、辽宁、天津和黑龙江,毒力基因阳性率分别为22%、22%、20%、15%和13%。(2)1308株副溶血性菌株的抗生素敏感性测定结果显示,所有菌株对头孢噻肟和头孢他啶两种抗生素均为敏感,对头孢唑啉的耐药现象最为严重,耐药率93.2%,其次分别为氨苄西林(46.0%)、复方新诺明(3.1%)、四环素(1%),对庆大霉素、亚胺培南、环丙沙星、阿莫西林/克拉维酸、左氧氟沙星、氯霉素等几种抗生素的耐药率均不到1%。所有待测菌株对受试抗生素的多重耐药现象不严重。不同省份来源的副溶血性弧菌耐药率略有差异,海南、天津、江苏菌株耐药率均为100%,福建、河南、浙江、湖北、广西、黑龙江、广东、山东等省份的菌株耐药率均在90%以上,辽宁、河北、上海的菌株耐药率分别为88%、86%、79%。(3)建立了一种基于PCR技术的新型副溶血性弧菌血清型鉴定方法,采用所建P CR方法对1194株副溶血性弧菌的12种O群进行检测,并采用荧光PCR方法对其致病性较强的7种K型抗原进行检测。结果显示:我国14个省、自治区、直辖市的食源性副溶血性弧菌中至少包含12种O群,5种K群。其中O1、O2、O3、O4检出率较高,总占比约为60.5%。几种致病性较强的血清型分布为依次为:O1:K25血清型19株,O3:K6血清型17株,O4:K8血清型1株,总占比3.09%,与传统血清分型方法相比复核率较高。以上结果表明,本研究建立的基于PCR技术的新型副溶血性弧菌血清型分析方法快速、准确、高效,可用于副溶血性弧菌的进行血清学分型。
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